陈 旋，鲁秀才，2，吴 丹，2，杨 延，2

（1.滇西科技师范学院生物技术与工程学院，云南 临沧 677000；2.云南省红茶工程技术研究中心，云南 临沧 677000）

1 材料与方法

1.1 材料

咖啡种壳：取自云南省临沧市云县幸福镇咖啡厂咖啡豆湿法加工后的咖啡废弃物，去除种壳中的咖啡豆，密封于4℃冰箱贮藏，其中：粗蛋白（7.31±0.05）%，粗脂肪（2.67±0.04）%，灰分（8.15±0.01）%，水分（8.98±0.08）%，粗纤维（20.44±0.06）%，总糖（18.4±0.05）%。

菌种：酿酒曲（安琪酵母股份有限公司）。

1.2 试剂

无水乙醇：优级纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。

重铬酸钾：天津市风船化学试剂科技有限公司等。

无水乙醇、重铬酸钾：均为分析纯。

1.3 仪器与设备

主要仪器设备：由上海申安医疗器械厂生产的LDZF 50KB-LLL型立式压力蒸汽灭菌锅；由上海舜宇恒平科学仪器有限公司生产的754紫外可见分光光度计；由上海安亭科学仪器厂生产的TDL-4型台式离心机；由上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产的HHS型数显电热恒温水浴锅；由上海智城分析仪器制造有限公司生产的ZHWY-211D型恒温培养振荡器；由上海精科有限公司生产的PHS-3C型pH计。

1.4 试验方法

1.4.1 稀酸预处理

称取10 g咖啡种壳，按液固比8∶1加入3.50%硫酸，在110℃的条件下水解处理90 min，即咖啡种壳稀酸预处理水解液。

1.4.2 咖啡种壳发酵培养基

将预处理后的水解液进行过滤，收集滤液50 mL置于发酵瓶中，调节pH为5，在115℃的条件下灭菌30 min。

1.4.3 咖啡种壳发酵乙醇体积分数的测定

采用重铬酸钾氧化分光度法测定咖啡种壳发酵液中乙醇的含量。取2 mL发酵液于离心管中，以3 000 rpm/min转速离心2 min，取上清液1 mL于25 mL试管中，加5%的K2Cr2O7溶液2 mL，沸水浴10 min显色，迅速冷却至室温，加无菌水定容至10 mL，混合均匀，在590 nm处测定吸光值。以无水乙醇为标准品制作标准曲线，从标准曲线求出测定样品中乙醇含量。试验得到标准曲线回归方程：y=5.565 2x+0.023 1（R2=0.999 3）。

1.4.4 单因素试验

在无菌操作台内，于咖啡种壳发酵培养基中接种10%酿酒曲搅拌均匀，温度为35℃，在80 rmp/min转速下培养发酵。分别考察发酵时间为24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，接种量为5%、8%、10%、12%、15%，氮源为硫酸铵、磷酸二氢铵、酵母浸粉、蛋白胨、尿素时，对咖啡种壳发酵乙醇体积分数的影响。

1.4.5 正交试验设计方案

在单因素试验的基础上，选取接种量、发酵时间、磷酸二氢铵3个因素，利用正交试验设计法对咖啡种壳发酵乙醇的工艺进行优化，试验因素及水平编码如表1所示。

表1 正交试验因素及水平编码Tab.1 The orthogonal test factors and level codes

1.4.6 统计分析

采用SPSS 17.0数据处理软件，对试验数据进行统计分析，每组试验重复3次，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对咖啡种壳发酵制备乙醇的影响

当发酵时间为24 h时，乙醇体积分数最大为2.20%，故咖啡种壳发酵制备乙醇最佳时间为24 h。

2.1.2 接种量对咖啡种壳发酵制备乙醇的影响

接种量是发酵的基础，影响发酵效率和发酵效果，当接种量过多时，会提高发酵液的黏稠度，且受空间限制，不仅会减少菌种彼此之间的相互作用，还会减少发酵材料的接触面。同时，受底物营养物质的限制，接种量过多会造成菌种之间的相互竞争，大部分营养物质用于自身的供能，从而大大降低了乙醇的产生。如果接种量太少，底物中的营养物质被菌种用于生长繁殖，使底物中的糖源下降，发酵时间延长导致乙醇降低。同时，在发酵过程中，接种量的大小会影响酵母的生长，进而影响酒精发酵。结果如图1所示，在5%的接种量条件下，乙醇的体积分数最大，为2.41%，故最佳接种量为5%。

图1 接种量对乙醇体积分数的影响Fig.1 The effect of inoculation amount on ethanol volume fraction

2.1.3 不同氮源对咖啡种壳发酵制备乙醇的影响

氮源是生物体核酸、蛋白质和其他氮素化合物的构成材料。合适的氮源及其浓度，有利于菌种的生成，促进代谢产物的合成和分泌。氮源可分为有机、无机，根据二者组成的复杂程度以及是否有利于酿酒曲的基本营养需求，发酵培养基的氮源一般选择无机氮源。最为常见的无机氮源有硫酸铵和尿素，本试验选择硫酸铵、硫酸氢二铵、酵母提取液、蛋白胨、尿素5种氮源作为研究对象。结果磷酸氢二铵的乙醇体积分数为3.30%，高于其他氮源，故最源为磷酸氢二铵。

2.2 正交试验优化结果

根据单因素试验结果，选取接种量（A）、发酵时间（B）和磷酸氢二铵（C）3个因素，以乙醇体积分数为指标，采用L9（3）4正交表进行正交试验，结果如表2所示，各因素对乙醇体积分数影响的主次顺序为A＞B＞C。通过方差分析法，咖啡种壳发酵制备乙醇的最优工艺条件为A3B1C1，即接种量为25%，发酵时间12 h，磷酸二氢铵为0.1%。

表2 正交试验结果Tab.2 The orthogonal test results

由于尿素对咖啡种壳发酵制备乙醇的影响最小，以尿素为误差所在列考虑接种量、发酵时间的显著性，由表3可以看出接种量对咖啡种壳发酵制备乙醇的影响显著。

表3 正交试验方差分析Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

2.3 验证试验

对方差分析法所得优化条件进行验证试验，乙醇体积分数为2.80%。故咖啡种壳发酵制备乙醇的最佳方案为A3B1C1。即接种量为25%，发酵时间12 h，磷酸二氢铵为0.1%。

3 结论

本试验以咖啡种壳为原料，通过对影响咖啡种壳发酵制备乙醇的3个因素（接种量、发酵时间、氮源）进行单因素试验，在此基础上进行正交试验，确定咖啡种壳发酵制备乙醇最优工艺条件是接种量为25%、发酵时间12 h、磷酸二氢铵为0.1%，实际测定乙醇体积分数为2.80%。表明选择设计合适的发酵工艺条件对提高乙醇含量至关重要，可为生物质能源乙醇的大规模工业化生产提供相应的工艺参数和理论依据，同时也为咖啡加工后废弃物的综合利用和深入研究奠定了基础，避免了资源浪费。