孙家栋，李雪梅，刘君玲

0 引 言

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童最为常见的恶性实体肿瘤，具有高发病率、高病死率、预后差等特点，近些年基因治疗、免疫生物治疗等成为研究热点[1]。肿瘤抑制因子圆柱瘤基因(cylindroma，CYLD)基因是2003年在Nature杂志报道的肿瘤抑制基因，在人体内广泛存在，作为一个去泛素化酶，可通过抑制JNK、NF-κB、Wnt/β-catenin等信号通路激活，从而在细胞周期调控、肿瘤发生抑制等事件中发挥重要作用[2-3]。近些年研究表明，CYLD与多种实体肿瘤发生密切相关[4-5]。CYLD在神经母细胞瘤研究极少，有研究发现，在神经母细胞瘤患者CYLD高表达，与总生存期延长、预后较好有关，且与分期呈现负相关[6]。CYLD对神经母细胞瘤细胞生物学特性及机制研究尚未清楚。因此，本研究以人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y为模型，将pcDNA3.1-CYLD质粒转染SH-SY5Y细胞，观察细胞活力、凋亡率情况，并进一步研究其对ROS及NF-κB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器DMEM培养基、FBS均购自美国Gibco；CYLD抗体、p52抗体、cyclinD1抗体和Bax抗体均购自美国CST；ROS检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；MTT购自美国Sigma；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基；酶标仪购自美国BioTek；流式细胞仪购自美国BD。

1.2细胞培养人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y购自中国科学院上海细胞库。细胞常规复苏后用在胎牛血清的DMEM培养基，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养。2 d换1次培养液，细胞长满培养瓶壁即可传代。

1.3分组及转染将SH-SY5Y细胞分为3组，即空白组、pcDNA3.1组(转染空白pcDNA3.1质粒)和pcDNA3.1-CYLD组(转染pcDNA3.1-CYLD质粒)。其中pcDNA3.1-CYLD质粒及空白pcDNA3.1质粒均由上海吉玛完成。参照……