袁溢苒 陈龙 张臻

肝癌，包括成人的肝细胞癌(HCC)和胆管癌(CCA)，以及主要在儿童中发病的肝母细胞瘤(HB)，是目前对抗癌药物反应不良的最恶性肿瘤之一[1-2]。有许多证据表明，多种miRNA在肝癌组织中显示失调，并在癌症的发展中起重要作用，包括miR-548a-5p[3-4]。miR-548a-5p是前列腺疾病的病程变化的肿瘤标志物[5]。然而，关于miR-548a-5p在肝癌中的生物学作用，目前尚未有研究。miR-548a-5p是否与凋亡相关，其潜在的分子机制值得探讨。基于此，本研究以肝癌细胞HepG2作为研究对象，旨在探讨miR-548a-5p调控肝癌细胞HepG2凋亡的潜在机制。

材料与方法

一、一般材料

肝癌细胞HepG2购自procell公司(货号：CL-0103)。LIPOFECTAMINE MESSENGERMAX转染试剂购自英潍捷基(上海)贸易有限公司(货号：LMRNA008)。GAPDH的抗体购自上海机纯实业有限公司[货号：ml4041550(s)]。HMBOX1(homeobox containing 1)抗体购自北京达科为生物技术有限公司(货号：10R-1687)。siGFP和siHMBOX1(靶序列：GGAAGTTCATATGGGAATA)由吉凯基因合成。HMBOX1过表达质粒通过肝癌细胞HepG2的cDNA克隆至pCDNA3.1表达载体上。RPMI-1640培养基购自北京普益华科技有限公司(货号：R8005-10X1L)。胎牛血清购自广州市左克生物科技发展有限公司(货号：HQ30071)。总RNA小量提取试剂盒购自广州市左克生物科技发展有限公司(货号：T2010S)。实时荧光定量PCR试剂盒购自广州聚研生物科技有限公司(货号：116.C6028-50T)。M-MLV逆转录酶购自广州市齐云生物技术有限公司(货号：R1041)。

二、研究方法

(一)细胞培养与转染 人肝癌细胞系HepG2(HCC/HB)在补充有10% FBS的RPMI-1640培养基中培养。根据制造商的说明，LIPOFECTAMINE MESSENGERMAX转染试剂与siGFP、siHMBOX1、miR-548a-5p mimics、miR-548a-5p inhibitor、Vector和HMBOX1混合后转染HepG2细胞。

(二)免疫印迹 从用RIPA裂解缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠，150 mmol/L NaCl和1 mmol/L PMSF裂解的细胞中提取总蛋白，并用BSA测定浓度方法。通过在10%聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离蛋白(30 μg/泳道)，然后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。……