周丽萍 林德菊 周斌杰 姚盼盼 余勤

浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）是一种类似胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）的多能性干细胞，具有多向分化、自我更新等优势，同时能够克服ES在临床应用时涉及的移植免疫排斥与伦理道德问题，现已成为再生医学的研究热点[1]。已有研究证实，iPS经过诱导可分化为多种神经细胞，如神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[2-4]，是神经系统疾病细胞移植治疗的理想种子细胞。然而，目前其诱导分化机制仍不明确。

近年来，大量研究表明Wnt/β-catenin信号通路可调控神经发生和神经元分化[5-7]，而β-连环蛋白（βcatenin）在该过程中起着关键作用[8-9]。因此，本研究以Wnt信号通路激活剂Wnt3a、抑制剂Dickkopf相关蛋白-1（Dickkopf-1，DKK-1）和IWR-1为干预因素，探讨Wnt/β-catenin信号通路在iPS向神经干细胞分化调控中的作用及相关机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞 妊娠13.5d的清洁级CF1小鼠，用于小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）的获取，购于上海市计划生育科学研究所实验动物经营部[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006]，饲养于浙江中医药大学动物实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012]。小鼠iPS由本课题组前期研究建立[10]。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清、N2添加剂、B27添加剂、放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解原液、神经基础培养基均购于美国Thermo Fisher公司（批号：1704207、1731337、1736741、89900、1749050）；小鼠Wnt3a重组细胞因子、人DKK-1重组细胞因子均购于美国PeproTech公司（批号：96-315-20-10、96-120-30-10）；小分子抑制剂IWR-1购于美国Selleck公司（批号：S7086）；维甲酸（retinoic acid，RA） 购于美国Sigma公司（批号：R2625）；β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulin Ⅲ）、β-catenin抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗体、山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）H&L抗体均购于Abcam公司（批号：ab68193、ab32572、ab181602、ab150077）；……