王一飞 薛锋

(上海市奉贤区中心医院骨科，上海 201400)

骨折愈合的过程是骨再生的过程，需要适合的生物力学环境，还要通过多种组织和细胞因子之间相互作用，促进骨折愈合〔1〕。研究数据显示，我国近几年高能量损伤和开放性损伤的患者人数增多，骨折不愈合的患者人数也有所增加〔2〕。骨折不愈合仍是治疗的难题，引起专家和学者的高度重视。研究数据显示，黄精多糖有降血脂、抗病毒、提高免疫功能、延缓衰老的功效〔3,4〕。本研究旨在探讨黄精多糖对胫骨骨折模型大鼠骨折愈合的作用机制。

1 材料与方法

1.1研究对象 选择23只SD健康雄性大鼠，由三峡大学实验动物中心提供。大鼠年龄为6～9周龄，平均(7.5±0.5)周龄，体重为210～220 g,平均(214.4±3.5)g，饲养温度为22～25℃，室内湿度35%～40%，饲养室定时进行紫外线照射消毒。统一喂给标准饲料，允许自由活动，饲养时间为1 w。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1胫骨骨折模型建立及分组 参考刘建军等〔5〕建模标准，并进行适当修改，选取18只大鼠使用5%水合氯醛进行腹腔麻醉，选取大鼠右后肢进行脱毛处理，消毒，在小腿1/3处行前正中切口，长度约1.5 cm，将大鼠皮肤、皮下组织和筋膜切开后，胫前肌扒开，在胫骨结节下1.0 cm处，将胫骨横行切断。采用1.0 mm的克氏针经过远端的髓腔穿出后，复位，采取逆行方式打入骨折的近端。之后使用生理盐水清洗干净，将切口逐层关闭。手术后对大鼠进行肌注青霉素8万U/100 g，1次/d，连续肌注3 d。建模过程中，死亡3只，建模成功15只。将15只大鼠随机分为模型组、低、高剂量黄精多糖组，各5只，正常组大鼠5只。黄精多糖溶入10 ml的生理盐水中，进行灌胃治疗，低剂量黄精多糖组大鼠服用剂量为100 mg/kg，高剂量黄精多糖组大鼠服用剂量为350 mg/kg，1次/d，正常组和模型组大鼠给予等体积的生理盐水治疗，连续治疗30 d。

1.2.2大鼠骨痂体积和胫骨湿重 大鼠处死前采集血清，抽取股动脉血，保存在肝素钠抗凝管中，每管2 ml，-20℃环境下保存，待测。大鼠处死后采用自制的照相模板将大鼠的下肢进行固定，正侧位拍摄X射线片，曝光参数设置：电压60 kV，电流7 mA，0.035 s，52 cm。观察大鼠的骨痂形成情况。取大鼠全长的胫骨，在进行标本采集的过程中，保护骨折周围组织，防止对骨痂造成破坏。将固定物去除后，使用天平称取全长胫骨湿重。

1.2.3观察大鼠胫骨近端骨形态 大鼠处死后采用Micro-CT骨形态计量学进行分析，将大鼠胫骨的肌肉、软组织剔除后，使用生理盐水将血液冲洗干净，做好标记后冻存。使用100 g/L的多聚甲醛将大鼠胫骨固定，使用Micro-Ct扫描，分辨率为18 μm。数据参数设置电压50 kV，电流500 μA，铜质滤片为0.5 mm进行扫描，主要检测指标包括：骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度。

1.2.4胫骨骨折骨组织形态学观察 所有大鼠处死后取出骨组织，在10%的甲醛固定保持48 h，脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡处理后，采用苏木素-伊红(HE)进行染色，在显微镜下(×100)观察大鼠胫骨骨折骨组织形态学特征。

1.2.5酶联免疫吸附试验测定篾这内皮生长因子(VEGF)、骨钙素及血清生化指标水平 采用50 mmol/L碳酸盐包被缓冲液将抗原进行溶解，浓度为10～20 μg/ml，在96孔酶标板中加入100 μl/孔，4℃过夜保存。第2天舍弃包被液，采用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤3次，没孔中加入1%的150 μl 牛血清白蛋白(BSA)，在37℃环境中封闭1 h。之后采用PBST洗涤3次，在每孔中加入100 μl不同倍比稀释度的血清，加入对照样品，37℃孵育2 h。采用PBST洗涤5次，加入100 μl,稀释后的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗涤5次，之后，使用显色剂显色20 min后，在酶标仪上读取A405吸收值，从而测定VEGF、骨钙素、钙、磷、碱性磷酸酶水平。

1.2.6Western印迹检测Col1a1、抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP)5、组织蛋白酶(CTS)K蛋白表达 将采集到的标本，使用PBS缓冲液清洗3遍以上，分离缓冲液，加入IP细胞裂解液，裂解处理35 min，提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，进行10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液15 min；100 V,电泳10 min，结束之后，将电转膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃环境下的摇床上封闭1.5 h；与一抗结合，加入TBST稀释按(1∶1 000)稀释一抗Tubulin(内参照)，在4℃的环境下孵育24 h；之后TBST缓冲液清洗处理，与二抗结合在室温下孵育1 h，使用TBST缓冲液反复清洗。加入显影剂将其浸在底物溶液中进行显色，严格按照显影定影试剂盒操作说明书进行。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组术后胫骨湿重和骨痂体积比较 低、高剂量黄精多糖组术后胫骨湿重和骨痂体积均显著高于模型组，且高剂量黄精多糖组显著高于低剂量黄精多糖组(均P<0.05)。见图1，表1。

图1 各组大鼠术后胫骨湿重和骨痂体积X线比较

表1 各组大鼠胫骨湿重和骨痂体积比较

2.2各组大鼠胫骨近端骨形态比较 各组骨小梁厚度比较无显著差异(P>0.05)。正常组、低、高剂量黄精多糖组骨体积分数、骨小梁数量均显著高于模型组(均P<0.05)；低、高剂量黄精多糖组骨体积分数、骨小梁数量均显著低于正常组(均P<0.05)；高剂量黄精多糖组骨体积分数、骨小梁数量显著高于低剂量黄精多糖组(P<0.05)。见图2，表2。

图2 4组大鼠胫骨近端骨Micro-Ct比较

表2 各组胫骨湿重、骨痂体积及近端骨形态及VEGF、骨钙素及血清生化指标水平比较

2.3各组大鼠胫骨骨折骨组织形态学观察 正常组骨组织清晰，可观察到骨板；模型组骨组织破坏严重，骨细胞数量显著减少；低剂量黄精多糖组骨组织中有少量的成骨细胞聚集；高剂量黄精多糖组骨组织中有大量的成骨细胞。见图3。

图3 4组大鼠胫骨骨折骨组织形态学观察(HE，×100)

2.4各组VEGF、骨钙素及血清生化指标水平比较 正常组、低、高剂量黄精多糖组VEGF、骨钙素、钙、磷、碱性磷酸酶水平均显著高于模型组(均P<0.05)；低、高剂量黄精多糖组VEGF、骨钙素、钙、磷、碱性磷酸酶水平均显著低于正常组大鼠(均P<0.05)；高剂量黄精多糖组VEGF、骨钙素、钙、磷、碱性磷酸酶水平均显著高于低剂量黄精多糖组大鼠(均P<0.05)。见表2。

2.5各组Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表达比较 正常组、低、高剂量黄精多糖组Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表达水平均显著低于模型组(均P<0.05)；低、高剂量黄精多糖组Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表达水平显著高于正常组(P<0.05)；高剂量黄精多糖组Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表达水平显著低于低剂量黄精多糖组(P<0.05)。见表3。

表3 4组Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表达比较

3 讨 论

骨折愈合的过程包含多个阶段，同时受机体中多因素调控，翁文玉等〔6〕研究指出，骨折愈合过程中有多种细胞因子参与，通过细胞外基质的重建作用，一些血清因子在骨形成的过程中发挥着重要作用。在正常的骨组织中有大量的神经分布，相关数据显示，在骨膜和骨质中也存在大量的神经纤维〔7，8〕。在骨新陈代谢中，大量的神经肽物质参与，主要通过骨膜和骨髓血流和血管的改变，对骨细胞和破骨细胞的活性产生显著的影响〔9〕。

本研究结果说明黄精多糖对大鼠胫骨骨折愈合有一定的积极作用。研究显示成骨细胞影响骨形成，破骨细胞影响骨吸收，是骨重建过程中重要的细胞因子，当破骨细胞活性提高，成骨细胞的活性降低时，破骨细胞影响旧骨的吸收速度，其影响强度大于成骨细胞对新骨的影响〔10，11〕。张磊等〔12〕研究结果显示，黄精多糖在治疗绝经后骨质疏松模型大鼠中骨密度水平升高，控制了骨丢失，改善了骨微环境。

VEGF在血管生成过程中发挥着关键性的作用，对内皮细胞有激活作用，促进聚集，有助于细胞之间的整合和成熟〔13〕。武永娟等〔14〕研究显示成骨细胞因子和血管细胞因子之间相互作用，在骨愈合中得到释放，可提高骨愈合的速度。孙成群等〔15〕研究指出，经过治疗后，骨痂中的血管因子显著表达，软骨细胞的数量增加，骨痂形成，促进钙化，缩短了骨髓腔再通时间。本研究结果说明黄精多糖能改善骨钙素、钙、磷、碱性磷酸酶水平。何基琛等〔16〕研究指出，黄精多糖能抑制巨噬细胞向破骨细胞分化，但其干扰机制有待进一步的研究。ACP5属于一种单体金属蛋白酶，主要在哺乳动物糖基化中表达，在活化的破骨细胞中显示高水平，是破骨细胞实现分化的重要标志性因子〔17〕。CTSK是肽酶C1家族的重要成员，集中在破骨细胞中表达，在骨吸收过程中发挥着重要作用〔18〕。破骨细胞主要是由大量的单核巨噬细胞融合形成，主要的作用是分解酸、溶酶体及分解骨基质，在机体中促进血钙的调节〔19，20〕。本研究说明黄精多糖对骨形成相关蛋白有显著的抑制作用，通过促进VEGF、骨钙素水平表达抑制Col1a1、ACP5、CTSK相关蛋白的表达。其中高剂量的黄精多糖作用效果更加明显。说明黄精多糖在成骨细胞和破骨细胞的分化过程中发挥着关键性的作用。

综上，黄精多糖对胫骨骨折模型大鼠作用显著，能改善骨微环境，黄精多糖通过促进VEGF、骨钙素表达抑制Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表达，促进骨折愈合。