周景芬 张开 张林英 张炜琦 罗娜 孙洪

(武汉市第一医院 1老年病科，湖北 武汉 430022；2皮肤科；3老年医学科)

阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病，多发生于中老年人群，其以记忆力减退及认知功能缺失为主要临床表现〔1〕。既往研究显示β淀粉样蛋白(Aβ)沉积在AD发生发展过程中发挥重要作用，促进淀粉样蛋白前体蛋白(APP)水解成Aβ造成Aβ异常沉积从而引起脑部组织炎症反应最终造成脑组织萎缩及神经元丢失等症状〔2〕。因而抑制APP蛋白表达可延缓AD发生发展。

研究表明小檗碱(BBR)可减少Aβ蛋白累积从而改善AD小鼠的痴呆症状，并可有效保护神经细胞〔3〕。但BBR在AD发生发展中的作用机制尚未完全阐明。研究〔4，5〕预测显示微小RNA-137(miR-137)可能是APP上游调控基因，研究表明上调miR-137的表达可影响肿瘤细胞的增殖及凋亡，还可通过调控其下游分子丝氨酸棕榈酰转移酶表达而延缓Aβ沉积。miR-137在Aβ诱导的神经毒性细胞中低表达，并可在AD发病过程中发挥重要作用〔6，7〕。本研究旨在探讨BBR对人Aβ25～35诱导的SK-N-SH细胞增殖及凋亡的影响，分析其对miR-137/APP的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 BBR购自湖北裕兴化工制药有限公司；Aβ25～35干粉购自美国GenScript公司；人SK-N-SH神经细胞瘤细胞购自美国ATCC细胞库。RPMI1640培养基购自武汉纯度生物科技有限公司；胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清(FBS)购自上海江林生物科技有限公司；噻唑蓝(MTT)购自北京百奥莱博科技有限公司；凋亡试剂盒购自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；Trizol试剂购自北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂盒与荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；双荧光素酶报告基因载体及活性检测试剂盒均购自美国Promega公司；miR-137模拟物(mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-con)、miR-137特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-137)及其阴性对照(anti-miR-con)均购自广州锐博生物科技有限公司；兔抗人细胞周期蛋白(Cyclin)D1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase-3)抗体购自美国Abcam公司；兔抗人APP多克隆抗体购自上海生工生物工程股份有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1药物处理及实验分组 SK-N-SH细胞放入含有10% FBS的RPMI1640培养基培养，用20 μmol/L的Aβ25～35处理SK-N-SH细胞建立AD模型〔8〕。实验设置分组：NC组(未经Aβ25～35诱导SK-N-SH细胞)、Aβ25～35组(Aβ25～35处理SK-N-SH细胞24 h)、10 μmol/L BBR组(含有20 μmol/L的Aβ25～35与10 μmol/L BBR的培养液培养SK-N-SH细胞24 h)、20 μmol/L BBR组(含有20 μmol/L的Aβ25～35与20 μmol/L BBR的培养液培养SK-N-SH细胞24 h)、40 μmol/L BBR组(含有20 μmol/L的Aβ25～35与40 μmol/L BBR的培养液培养SK-N-SH细胞24 h)、80 μmol/L BBR组(含有20 μmol/L的Aβ25～35与80 μmol/L BBR的培养液培养SK-N-SH细胞24 h)。采用MTT法检测各组SK-N-SH细胞存活率及凋亡率，筛选适宜浓度进行后续研究。为探究miR-137表达变化对Aβ25～35诱导SK-N-SH细胞存活及凋亡的影响，实验设置分组：Aβ25～35+miR-con组(miR-con转染至SK-N-SH细胞48 h，含有20 μmol/L的Aβ25～35培养液培养SK-N-SH细胞24 h)、Aβ25～35+miR-137组(miR-137 mimics转染至SK-N-SH细胞48 h，含有20 μmol/L的Aβ25～35培养液培养SK-N-SH细胞24 h)。分析miR-137对APP的靶向调控作用，实验分组：miR-con组(miR-con转染至SK-N-SH细胞48 h)、miR-137组(miR-137 mimics转染至SK-N-SH细胞48 h)、anti-miR-con组(anti-miR-con转染至SK-N-SH细胞48 h)、anti-miR-137组(anti-miR-137转染至SK-N-SH细胞48 h)。后续实验验证黄连素是否调控miR-137/APP表达而发挥作用，实验分组：Aβ25～35+BBR+anti-miR-con组(anti-miR-con转染至SK-N-SH细胞48 h，含有20 μmol/L的Aβ25～35与40 μmol/L BBR的培养液培养SK-N-SH细胞24 h)、Aβ25～35+BBR+anti-miR-137组(anti-miR-137转染至SK-N-SH细胞48 h，含有20 μmol/L的Aβ25～35与40 μmol/L BBR的培养液培养SK-N-SH细胞24 h)。

1.2.2MTT检测细胞增殖 收集对数生长期SK-N-SH细胞5×104个/ml，取100 μl细胞悬液接种于96孔板，按照1.2.1设置分组后，每个处理设置3个复孔，每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，充分混匀，应用酶标仪检测波长为490 nm处各孔光密度值(OD)值。细胞存活率(%)=〔(实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常培养组OD值-空白对照OD值)〕×100%。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组SK-N-SH细胞，0.25%胰蛋白酶消化，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，1 000 r/min转速离心5 min(4℃，离心半径6 cm)，收集细胞沉淀，加入500 μl结合缓冲液悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-FITC，充分混匀，加入5 μl PI，充分混匀，室温避光孵育20 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4qRT-PCR检测细胞中miR-137表达水平 采用Trizol法提取SK-N-SH细胞总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计测定RNA浓度，参照反转录试剂盒将总RNA合成cDNA。qRT-PCR反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，ddH2O补足体系至20 μl。miR-137以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-137相对表达量。

1.2.5荧光素酶报告基因检测 Starbase预测显示miR-137与APP的3′UTR区存在结合位点，构建含有miR-137结合位点的APP-3′UTR野生型(WT-APP)及突变型(MUT-APP)报告基因载体，在AD模型细胞中转染miR-137和APP野生型及突变型报告基因载体，参照荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值)。

1.2.6Western印迹检测CyclinD1、cleaved-caspase-3、APP蛋白表达 收集各组SK-N-SH细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，取30 μg蛋白上样量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，电泳结束后将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温条件下采用5%脱脂牛奶封闭2 h，4℃孵育过夜，加入蛋白一抗(1∶1 000)，TBST洗涤，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，曝光，显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1BBR对SK-N-SH细胞的增殖的影响 与NC组存活率〔(100±10.22)%〕比较，Aβ25～35组〔(55.32±5.85)%〕SK-N-SH细胞存活率显著降低(P<0.05)；相较于Aβ25～35组，10、20、40、80 μmol/L BBR组SK-N-SH细胞存活率显著升高〔(60.22±6.23)%、(73.96±7.10)%、(90.35±9.05)%、(91.22±9.12)%，P<0.05〕，其中20 μmol/L BBR组、40 μmol/L BBR组SK-N-SH细胞存活率相对较高，因而选用20、40 μmol/L BBR组进行后续研究。

2.2BBR对SK-N-SH细胞凋亡的影响 与NC组相比，Aβ25～35组SK-N-SH细胞凋亡率与cleaved-caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)；相较于Aβ25～35组，20 μmol/L BBR组、40 μmol/L BBR组SK-N-SH细胞凋亡率与cleaved-caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)，见图1、表1。

A:流式细胞仪检测细胞凋亡;B:Western印迹检测cleaved-caspase-3蛋白表达;1～4:NC组、Aβ25～35组、20 μmol/L BBR组、40 μmol/L BBR组图1 不同浓度BBR对SK-N-SH细胞凋亡的影响

表1 不同浓度BBR对SK-N-SH细胞凋亡的影响

2.3BBR对miR-137表达的影响 与NC组(1.00±0.12)相比，Aβ25～35组SK-N-SH细胞中miR-137的表达水平显著降低(0.35±0.03，P<0.05)；与Aβ25～35组比较，20 μmol/L BBR组、40 μmol/L BBR组SK-N-SH细胞中miR-137的表达水平均显著升高(0.66±0.08，0.90±0.09，均P<0.05)。

2.4miR-137过表达对SK-N-SH细胞活力和凋亡的影响 与Aβ25～35+miR-con组相比，Aβ25～35+miR-137组SK-N-SH细胞存活率和CyclinD1蛋白水平显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)，见图2、表2。

1～4：NC组、Aβ25～35组、Aβ25～35+miR-con组、Aβ25～35+miR-137组图2 Western印迹检测CyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表达

表2 miR-137过表达对SK-N-SH细胞活力和凋亡的影响

2.5miR-137靶向调控APP的表达 Starbase对miR-137和APP结合位点进行预测，见图3A；miR-137组(WT-APP)荧光素酶活性显著低于miR-con组(1.00±0.11，P<0.05)；miR-137组APP水平(0.45±0.05)显著低于miR-con组(1.25±0.13)，anti-miR-137组APP水平(1.86±0.20)显著低于anti-miR-con组(1.28±0.12，均P<0.05)，见图3B。

2.6低表达miR-137通过负向调控APP表达逆转BBR对SK-N-SH细胞活力和凋亡的影响 与Aβ25～35+BBR+anti-miR-con组比较，Aβ25～35+BBR+anti-miR-137组SK-N-SH细胞存活率和CyclinD1蛋白水平显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)，见图4、表3。

A：生物信息软件预测miR-137与APP靶向关系；B：Western印迹检测APP蛋白表达量图3 miR-137靶向APP，调控APP表达

1～4：Aβ25～35组、Aβ25～35+BBR组、Aβ25～35+BBR+anti-miR-con组、Aβ25～35+BBR+anti-miR-137组图4 Western印迹检测APP、CyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表达

表3 低表达miR-137通过负向调控APP表达逆转黄连素对SK-N-SH细胞活力和凋亡的影响

3 讨 论

AD发生发展与氧化应激及神经细胞凋亡密切相关，研究表明Aβ可促进炎症反应的发生，促进神经元细胞变性及死亡〔9，10〕。目前AD治疗药物的作用机制尚未完全阐明，因而深入研究药物抗AD的分子机制对AD的防治具有重要意义。BBR主要从中草药黄连中提取，研究表明BBR可通过抑制JNK信号通路激活从而缓解Aβ1～42诱导的细胞凋亡〔11〕。研究表明BBR可通过抗神经炎症、抗凋亡等多种机制从而保护神经系统〔12〕。相关报道指出BBR可通过下调基质金属蛋白酶(MMP)-9的表达从而保护自身免疫性脑脊髓炎大鼠神经功能〔13〕。本研究结果提示BBR对Aβ25～35诱导的SK-N-SH细胞存活具有促进作用；BBR对Aβ25～35诱导的SK-N-SH细胞凋亡具有抑制作用。细胞凋亡过程涉及多种致凋亡因子，caspase-3是细胞凋亡过程中的执行分子，正常生理条件下，caspase-3以酶原的形式存在于细胞质内，细胞受到凋亡信号时，caspase-3被激活后形成有活性的片段从而诱导细胞凋亡，研究表明抑制caspase-3的活化可抑制细胞凋亡〔14〕。本研究结果提示BBR可能通过下调cleaved-caspase-3的表达而抑制AD模型细胞凋亡。

miRNA可通过调控下游靶基因表达从而参与神经系统发育过程，研究表明miR-137可参与AD等多种神经系统疾病发生过程〔15，16〕。相关报道指出miR-137可通过调控神经酰胺/Aβ通路进而发挥抗AD的作用〔17〕。与上述研究报道相似，本研究结果BBR可能通过上调miR-137的表达从而发挥抗AD的作用；miR-137过表达可通过调控细胞增殖及凋亡相关蛋白的表达从而对Aβ25～35诱导的SK-N-SH细胞发挥保护作用。本研究证实APP是miR-137的靶基因，miR-137可靶向调控APP的表达，研究表明抑制APP的表达可保护神经细胞，并可提高小鼠认知及记忆能力〔18，19〕。为证实BBR是否通过调控miR-137、APP的表达从而保护AD模型神经细胞，本研究结果提示BBR可通过上调miR-137的表达及下调APP的表达从而保护AD模型神经细胞。

综上，BBR可抑制Aβ25～35诱导的SK-N-SH细胞凋亡，其作用机制可能是上调miR-137的表达及抑制APP的表达而发挥作用，可为治疗AD相关新药的研发提供理论依据。但仍需进行体内实验进一步验证BBR抗AD的药效及其可能的作用机制。