【摘要】骨组织钙化沉积，含有大量胶原纤维，较难提取出纯净的RNA。通过实验条件摸索在传统的Trizol法进行改进，利用电动研磨棒研磨小鼠骨组织，再用Trizol和水饱和酚2：1裂解，加大离心转速，氯仿提纯后上清液与异丙醇、钠盐的比例为1：0.75：0.2混合提纯。用此方法得到的RNA浓度、纯度均高于对照组，完整性良好，可以用于后期小鼠骨组织分子生物学研究。

【关键词】小鼠;骨组织;RNA

【中图分类号】R580        【文献标识码】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.14.293

研究疾病相关的靶点和作用机制常用分子生物学的实验方法，其中RT-PCR（reverse transcription-PCR）逆转录技术被广泛应用。RT-PCR技术是将RNA链逆转录成为CDNA，再以此为模板通过PCR技术进行DNA扩增，以此实现基因表达和基因定量分析的目的[1]。提取纯净的RNA 是RT-PCR技术的基础前提。目前大部分的组织样本均可采用经典Trizol法提取RNA，效果较好。

而骨组织钙化、硬度大，裂解过程困难，即使裂解成功，骨组织内钙盐沉积、骨细胞密度低，胶原纤维杂质多等问题导致较难得到高质量的RNA[2]。对于提骨RNA的实验方法一直在探索过程中，本实验在传统的Trizol法上进行改良研究，摸索出有效提取骨组织中RNA的方法，有利于推动骨相关疾病的机制研究。

1  材料和方法

1.1主要试剂和仪器

TRIzol提取液（Invitrogen公司），1 %非变性琼脂糖凝胶，75%乙醇、氯仿、异戊醇、水饱和酚、DEPC水、钠盐。低温离心机（Thermo公司），医用超净工作台（SW-CI-IFD公司），NANODrop2000c（Thermo公司），胶成像分析系统 （Bio-Rad公司）。

1.2组织来源

健康昆明种小白鼠6只，雄性，4周龄，体重20 - 30 g。采用脱颈法处死，迅速解剖剥离双侧胫骨组织，用生理盐水冲洗干净，放于液氮中保存。

1.3骨RNA提取

第一组（对照组）：随机称取25 g的骨组织3份，在标准条件下用传统Trizol法一步裂解，氯仿纯化、异丙醇沉淀、乙醇再纯化，干燥后得到3份RNA沉淀，每份加入10μL DEPC水溶解。

第二组（改良组）：随机称取25 g的骨组织3份放入2mlEP管中，每份加入300 μL的TRIzol浸泡5 min后，加入150 μL水饱和酚电动研磨成组织匀浆;每管补加700 μL的TRIzol和300 μL水饱和酚，涡旋充分混合，静置10 min后分三层;吸取上清液转入含有滤膜的2 mLEP管中，4℃離心13500转15 min;取上清液，加入500 μL氯仿，再次重复涡旋静置离心;取上清液按1∶0.75∶0.25的比例加入异丙醇和钠盐，同上涡旋静置离心;弃上清，沉淀加入75 %的乙醇800 μL，同上涡旋静置离心;弃上清，沉淀加入10 μL的1 ‰DEPC水溶解。

1.4 RNA样品浓度、纯度及完整性检测

两组RNA 样品分别用NANODrop2000c型紫外分光光度计测定核酸的浓度C （μg/ml），和 纯度（A260 / A280值）。用1 %非变性琼脂糖凝胶，在电压110V，30min 电泳，观察 RNA 的 28S、18S条带是否清晰，判断 RNA的完整性及有无 DNA污染。

2  结果

2.1 RNA浓度

在提取过程中肉眼可见对照组提取的RNA有明显白色块状物，加入DEPC水后不能溶解，而改良组提取的RNA呈白色絮状，能轻易被DEPC溶解。对照组和改良组提取的RNA 经紫外分光光度计检测的浓度如图1，改良组的浓度值明显高于对照组（P<;0.05）。

2.2 RNA纯度

对照组和改良组提取的RNA 经紫外分光光度计检测的纯度如图2，改良组的纯度值明显高于对照组（P<0.05）。对照组的纯度均低于1.85，改良组的RNA纯度均高于1.85。

2.3 RNA完整性

两组的总 RNA经EB染色，1%琼脂糖凝胶电泳后观察到对照组条带成团高亮，弥散明显，疑为蛋白多糖类或 DNA小片段污染。改良组在28s，18s有清晰条带，无弥散出现，并且28S处条带明显比18S条带亮。证明改良组的RNA是完整的。

3  讨论

在传统的Trizol法提取骨RNA的过程中，发现RNA有白色沉淀不溶于DEPC水，测得浓度和纯度均不佳。经过文献查阅发现骨组织中RNA 较难提取的原因主要是，硬度大、裂解困难以及胶原纤维等杂质多。在本实验中也证实对照组的琼脂糖凝胶实验抱团弥散，证明RNA可能被胶原纤维蛋白多糖污染。针对以上问题，考虑在传统方法中加入电动研磨棒进行研磨，水饱和酚、钠盐提纯分离胶原纤维等杂质，水饱和酚能分离骨组织中的蛋白多糖，钠盐能另蛋白多糖溶解[3]已有部分研究提出相关思路。

但不同组织的提取方法略有差异，通过多次实验条件摸索，最终得到将Trizol和水饱和酚2：1裂解，加大离心转速，氯仿提纯后上清液与异丙醇、钠盐的比例为1：0.75：0.2混合提纯。在此实验条件下得到的小鼠胫骨RNA浓度纯度均佳，可以用于后续RT-PCR技术研究。

参考文献：

[1]金凤媚，薛俊，郏艳红，刘仲齐.半定量RT-PCR技术的研究及应用[J].天津农业科学，2008（01）：10-13.

[2]李丁，苏海川，赵锦荣，范清宇，闫小君.骨组织总RNA的提取[J].第四军医大学学报，1999（12）

[3]刘玉刚，胡旭，付建军，张莹，廖通权，周跃，初同伟.一种富含多糖的关节软骨组织总RNA提取方法初探[J].第三军医大学学报，2009，31（24）：2495-2497.

作者简介：

张荣浩（1995-），女，医学硕士，重庆化工职业学院专任教师，研究方向为药理学。