金浩 余佳 王梓瑜 乔鸥 王军 韩江 李兆连

(1云南省第一人民医院(昆明理工大学附属医院)普通外科，云南 昆明 650032；2武汉大学人民医院肝胆外科)

肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，病死率高〔1〕。治疗仍然采用外科手术为主的综合治疗方式，化学治疗、放射治疗等多元化治疗也取得了较大进展〔2〕。随着医学的不断发展，靶向治疗已成为肝癌治疗的新途径，靶向药物的出现给肝癌患者带来了新希望〔3〕。长链非编码RNA(LncRNA)是基因调控的重要组成部分，在表观遗传水平和转录中发挥重要的调控作用，研究发现，LncRNA参与肝癌的发生发展、预后治疗等过程〔4〕。DLEU2在宫颈癌中低表达，过表达DLEU2能抑制宫颈癌细胞Hela和Caski的增殖、迁移和侵袭〔5〕。DLEU2通过miR-16-1影响喉癌细胞的增殖，迁移和侵袭〔6〕。而DLEU2对肝癌的影响未见报道。LncRNA作为内源竞争RNA(ceRNA)调控miRNA丰富了肝癌的发生发展机制〔7〕。近年来研究发现，体内特定miRNA的表达能抑制肿瘤细胞增殖、转移及复发〔8〕。miR-374在肝癌细胞中上调表达〔9〕；miR-374a高表达能促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔10〕。本文旨在研究DLEU2对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其与miR-374a-5p的调控机制，为肝癌的早期诊断和治疗提供新靶点和新方法。

1 材料与方法

1.1材料 肝癌细胞HepG2、BEL-7402和正常肝细胞HL-7702购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；MTT试剂盒、二甲基亚砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS)购自Sigma公司；Trizol试剂、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、电化学发光(ECL)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；Transwell小室、基质胶购于美国BD公司；RIPA蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2细胞培养 肝癌细胞HepG2、BEL-7402和正常肝细胞HL-7702使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，每天换液1次，待细胞融和至60%～70%时，加入胰蛋白酶进行消化传代。选取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3细胞转染与分组 取常规培养的肝癌细胞HepG2用0.25%胰蛋白酶消化后接种于96孔板中，待细胞生长至80%融合，更换为无血清培养基同步化12 h，随后进行转染。转染分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-374a-5p组(转染miR-374a-5p mimics)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-DLEU2组(转染pcDNA3.1-DLEU2)、si-NC组(转染si-NC)、si-DLEU2组(转染si-DLEU2)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-374a-5p组(转染anti-miR-374a-5p)、miR-NC+WT-DLEU2组(共转染miR-NC和WT-DLEU2)、miR-NC+MUT-DLEU2组(共转染miR-NC和MUT-DLEU2)、miR-374a-5p+WT-DLEU2组(共转染miR-374a-5p和WT-DLEU2、miR-374a-5p+MUT-DLEU2组(共转染miR-374a-5p和MUT-DLEU2)、pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组(共转染pcDNA3.1-DLEU2和miR-NC)、pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p组(共转染pcDNA3.1-DLEU2和miR-374a-5p)，转染按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

1.4MTT检测细胞增殖 在各组细胞培养至24、48、72 h时加入20 μl(5 g/L)MTT溶液，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μl DMSO振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。细胞增殖活力=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.5Transwell检测细胞迁移和侵袭 各组细胞胰酶消化后使用无血清培养基重悬细胞，调整浓度为2×104个/ml。细胞迁移实验：取200 μl细胞悬液接种于Transwell小室上室中，并置于含完全培养基的下室中，37℃、5% CO2条件下培养24 h，取出小室，去除培养基后用棉签轻轻擦去上层细胞，PBS洗涤，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察并随机选取6个视野拍照，计算结晶紫染色细胞数即为迁移细胞数。细胞侵袭实验：以1∶5比例加入RPMI1640培养液稀释Matrigel后，铺于Transwell小室的上室，室温下干燥后，按照细胞迁移实验步骤操作。最后显微镜下观察结晶紫染色细胞数即为侵袭细胞数。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各组细胞，离心收集各组细胞，PBS漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)避光孵育。流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度。实验重复3次。

1.7qRT-PCR检测miR-374a-5p和DLEU2 mRNA表达水平 收集各组细胞，研磨充分后加入Trizol试剂提取总RNA，微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。使用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin为内参进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.8Western印迹检测 收集各组细胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，10 340 r/min离心15 min，收集蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。每个蛋白样品重复3次。

1.9荧光素酶报告基因检测实验检测DLEU2对miR-374a-5p的靶向调控 TargetScan数据库显示DLEU2 3′UTR区域有miR-374a-5p结合位点。构建野生型和突变型基因靶点DLEU2的3′UTR-荧光素酶表达载体(WT-DLEU2和MUT-DLEU2)，取对数生长期肝癌HepG2细胞接种于24孔板(5×104个/孔)，待细胞生长至80%融合时，用LipofectamineTM2000将WT-DLEU2和MUT-DLEU2组细胞分别转染miR-NC和miR-374a-5p。依据说明书要求，使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定。实验结果以荧光素酶活性和Renilla活性的比值进行统计学分析，实验重复3次。

1.10统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1DLEU2在肝癌细胞HepG2、BEL-7402和正常肝细胞HL-7702中的表达 qRT-PCR检测结果显示，与HL-7702组(1.33±0.13)相比，HepG2、BEL-7402组细胞中DLEU2 mRNA的表达水平(0.38±0.11、0.76±0.15)显著降低，3组比较差异有统计学意义(F=79.911，P=0.000)。

2.2DLEU2过表达对肝癌细胞HepG2增殖、凋亡的影响 Western印迹检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组HepG2细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。MTT法检测结果显示，在转染pcDNA3.1-DLEU2后，分别于24、48、72 h时检测细胞增殖，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组HepG2细胞活性显著降低(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示，相较于pcDNA3.1组，pcDNA3.1-DLEU2组HepG2细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表1，图1，图2。

图1 DLEU2过表达对肝癌细胞HepG2、BEL-7402凋亡的影响

图2 DLEU2过表达对凋亡蛋白表达的影响

表1 过表达DLEU2对细胞HepG2增殖、凋亡的影响

2.3DLEU2过表达对肝癌细胞HepG2的迁移、侵袭的影响 Western印迹检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组HepG2细胞中N-cadherin蛋白表达水平显著降低，E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。Transwell 法检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组HepG2细胞迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05)。见图3、图4、表2。

图3 DLEU2过表达对肝癌细胞HepG2的迁移、侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

图4 Western印迹检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达

表2 DLEU2对细胞HepG2迁移、侵袭的影响

2.4DLEU2靶向调控miR-374a-5p 通过TargetScan数据库预测到DLEU2与miR-374a-5p存在结合位点(图5)。荧光素酶报告基因检测实验结果显示，转染野生型DLEU2基因表达载体WT-DLEU2后，相较于miR-NC组，miR-374a-5p组WT-DLEU2肝癌细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染突变型DLEU2基因表达载体MUT-DLEU2后，相较于miR-NC组，miR-374a-5p组MUT-DLEU2肝癌细胞的荧光素酶活性差异不无统计学意义(P>0.05)，见表3。qRT-PCR检测结果显示，相较于pcDNA组(0.88±0.08)，pcDNA-DLEU2组肝癌细胞中miR-374a-5p的表达水平(0.13±0.01)显著降低(P<0.05)；相较于si-NC组(0.83±0.08)，si-DLEU2组(1.47±0.15)显著升高(P<0.05)。

表3 双荧光素酶报告实验

图5 DLEU2中含有miR-374a-5p的互补核苷酸序列

2.5抑制miR-374a-5p对肝癌细胞HepG2增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 qRT-PCR检测结果显示，与 anti-miR-NC组相比，anti-miR-374a-5p组细胞中miR-374a-5p的表达水平显著降低(P<0.05)；Western印迹检测结果显示，与 anti-miR-NC组相比，anti-miR-374a-5p组HepG2细胞中Bcl-2、N-cadherin蛋白的表达水平显著降低，Bax、E-cadherin蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。见图6，表4。

表4 抑制miR-374a-5p对凋亡、迁移、侵袭蛋白表达的影响

图6 抑制miR-374a-5p对细胞HepG2凋亡、迁移相关蛋白的表达

MTT法检测结果显示，与 anti-miR-NC组相比，anti-miR-374a-5p组HepG2细胞活性显著降低(P<0.05)。Transwell 法检测结果显示，与 anti-miR-NC组相比，anti-miR-374a-5p组HepG2细胞迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示，与 anti-miR-NC组相比，anti-miR-374a-5p组HepG2细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)。见表5。

表5 抑制miR-374a-5p对肝癌细胞HepG2增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

2.6过表达miR-374a-5p能逆转DLEU2对肝癌细胞HepG2增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用 qRT-PCR检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组细胞中miR-374a-5p的表达水平显著降低；与pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p组显著升高(P<0.05)。Western印迹检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组HepG2细胞中Bcl-2、N-cadherin蛋白的表达水平显著降低，与pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p组细胞中Bax、E-cadherin蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。见图7，表6。

表6 miR-374a-5p过表达对细胞HepG2中凋亡、侵袭蛋白表达的影响

MTT法检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组HepG2细胞活性显著降低；与pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p组细胞活性显著升高(P<0.05)。Transwell 法检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组HepG2细胞迁移和侵袭数量显著降低；与pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p组细胞迁移和侵袭数量显著升高(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-DLEU2组HepG2细胞的凋亡率显著升高；与pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p组显著降低(P<0.05)。见表7。

1～4：pcDNA3.1组、pcDNA3.1-DLEU2组、pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组、pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p组图7 过表达miR-374a-5p对凋亡、迁移相关蛋白表达的影响

表7 过表达miR-374a-5p能够逆转DLEU2对细胞HepG2增殖、凋亡的作用

3 讨 论

传统的手术治疗对早期肝癌有一定疗效，但仍存在癌症的复发、转移和耐药等问题，而靶向治疗可以降低或消除这些情况〔11〕。寻找影响肝癌发生发展及预后的肿瘤分子靶标和作用机制，对于肝癌早期诊断及术后患者长期生存有重要作用〔12〕。LncRNA的分子调控机制比较复杂，随着在肝癌中的研究，其在肝癌中占据越来越重要的作用〔13〕。DLEU2位于慢性淋巴细胞白血病的13q14删除基因座上〔14〕；DLEU2通过miR-15a/miR-16-1负调节G1细胞周期蛋白E1和D1进而抑制细胞增殖，抑制肿瘤细胞系集落形成〔15〕；DLEU2可提高miR-15a/miR-16-1的表达治疗慢性淋巴细胞白血病〔16〕。组蛋白去乙酰化酶抑制剂在非小细胞肺癌中通过HDAC3增加Dleu2/miR-15a/16-1的表达〔17〕。DLEU2还影响宫颈癌〔5〕、喉癌〔6〕的发展过程。但还未见DLEU2在肝癌中的相关研究，本研究结果表明，DLEU2在肝癌细胞中低表达，过表达DLEU2可抑制肝癌HepG2细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡；还能抑制Bcl-2、N-cadherin蛋白的表达，促进Bax、E-cadherin蛋白的表达。DLEU2可靶向调控miR-374a-5p的表达。

miR-374参与了多种疾病的进展，研究发现，miR-374a-5p是肥胖炎症过程的一种潜在调节剂〔18〕。上调miR-374b-5p可通过抑制RECK表达促进胃癌细胞转移和侵袭〔19〕。miR-374b-5p在胰腺癌组织中显著低表达，上调miR-374b-5p通过下调多种抗凋亡蛋白减弱了胰腺癌的化疗耐药性〔20〕。miR-374a-5p在骨肉瘤患者中的表达显著升高，作为骨肉瘤的潜在无创生物标志物〔21〕。miR-374a在膀胱尿路上皮癌患者中上调表达〔22〕；miR-374a-5p在乳腺癌〔23〕、肺癌〔24〕中上调表达。miR-374-5p下调可抑制雄性大鼠生长板软骨细胞增殖并促进肥大分化〔25〕。miR-374a-5p低表达有利于结肠癌患者的存活〔26〕。蛋白激酶C抑制剂GF109203X可诱导体外人表皮细胞去分化，上调miR-374a-5p的表达〔27〕。本研究结果表明，抑制表达miR-374a-5p可抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡；过表达miR-374a-5p能逆转DLEU2对肝癌细胞HepG2增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡的促进作用。

综上，LncRNA DLEU2可抑制肝癌细胞HepG2的增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡，其机制可能与靶向miR-374a-5p基因有关，将可为肝癌的早期诊断预防、治疗和预后提供新靶点。