胡澜也 陈洁 辛渊 方旭华 焦宇

上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心耳鼻咽喉口腔颌面外科(上海200127)

耳聋可由遗传因素或环境因素导致，至少一半的耳聋可归因于遗传因素，其中同时具备其他特殊临床特征的称为综合征性耳聋（syndromic hearing loss,SHL），不具备其他临床特征的称为非综合征性耳聋（nonsyndromic hearing loss,NSHL）[1,2]。前庭水管扩大（enlarged vestibular aqueduct,EVA）是导致NSHL的常见内耳畸形，典型特征为进展性感音神经性听力下降[3]，诊断主要依靠颞骨CT及MRI影像学检查[4]。1996年Griffith等[5]首次描述前庭水管扩大有家族遗传性，随后证实其与溶质转运家族26-成 员 4（solute carrier family 26 member 4,SLC26A4）基因变异相关[6]。迄今为止，在不同国家和种族中已发现超过500种SLC26A4基因变异（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=SLC26A4）。本研究中，我们对1例EVA听障患儿及其父母进行全外显子测序，发现了1种SLC26A4基因的新变异，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

先证者为一名2岁女孩。患儿及其父母均来自中国河南省，为汉族人。患儿出生听力筛查未做，自幼对声反应差，言语发育迟缓。出生时无窒息等异常，既往无脑膜炎、耳外伤、耳毒性药物应用史，无耳聋家族史。来我院行人工耳蜗植入手术，术前进行体格检查、听力学检查和影像学检查。

本研究通过本院伦理委员会论证批准，并由法定监护人签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 听力学检查与影像学检查

患儿术前进行的听力学检查包括耳镜检查、畸变产物耳声发射（distortion product otoacoustic emission,DPOAE）、声导抗、听觉脑干诱发电位（auditory brainstem response,ABR）和多频稳态诱发电位（auditory steady-state response,ASSR）。影像学检查包括颞骨CT和内耳MRI。根据世界卫生组织倡导的耳聋分级标准，听力损失程度分为：轻度（26～ 40dB HL）、中度（41～ 60dB HL）、重度（61～ 80dB HL）和极重度（>80dB HL）。由于受试者年龄较小，无法配合纯音听阈测试，取ASSR 0.5-4kHz范围内的平均阈值作为定向条件反射的近似值[7]。

1.2.2 基因测序与变异验证

分别采集患儿及其父母的外周血3～ 5ml，枸橼酸钠抗凝，应用Gentra Puregene血液试剂盒（Qiagen,德国）提取基因组DNA，具体步骤参照试剂盒说明书。利用试剂盒SureSelectXT Library Prep Kit（Ag‐ilent Technologies,美国）捕获外显子，在测序平台Illumina Hiseq X Ten System（Illumina，美国）上进行高通量测序。测序数据经软件NextGENe®（Soft‐Genetics，美国）匹配分析后，上传至在线软件系统Ingenuity Variant Analysis（Ingenuity Systems，美国）进行变异过筛及解释，候选变异经北京六合华大基因科技有限公司上海分公司进行Sanger测序验证。

1.2.3 生物信息学分析

应 用 PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、PROVEAN（http://provean.jcvi.org/ge‐nome_submit_2.php?species?human）、SIFT（http://sift.Jcvi.org/）和 MutationTaster（http://www.muta‐tiontaster.org/ChrPos.html）预测SLC26A4基因变异的潜在致病性。

2 结果

2.1 临床检查结果

术前常规全身体格检查及专科检查未见明显异常。DPOAE示双耳未引出；声导抗示双耳A型；气导ABR示左耳反应阈90dB nHL，右耳反应阈100dB nHL；骨导ABR示双耳反应阈大于40dB nHL；ASSR示双耳极重度感音神经性聋。颞骨CT示双侧前庭水管扩大；内耳MRI可见T2WI序列双侧小脑半球表面扩大的内淋巴囊和前庭水管（图1）。

图1 内听道MRI可见前庭水管扩大（蓝色箭头所指处）和内淋巴囊扩大（红色箭头所指处）Fig.1 The inner ear MR scan images show the enlarged ves‐tibular aqueduct(blue arrows)and the enlarged endolymph sac(red arrows)

2.2 基因检测及生物信息学分析结果

先证者存在SLC26A4c.919-2A>G（c.IVS7-2A>G）和c.403C>A（p.His135Asn）的变异（图2）。父亲为c.919-2A>G的杂合变异携带者，母亲为c.403C>A的杂合变异携带者（图3）。

图2 先证者及其父母基因测序图中的异常序列。先证者在SLC26A4基因中呈c.403C>A/c.919-2A>G变异，其中c.403C>A来源于母亲，c.919-2A>G来源于父亲Fig.2 Sequence electropherograms of abnormal sequences from three members of this family.The proband harbored two variants in the SLC26A4 gene in the form of c.403C>A/c.919-2A>G.The proband’s father was a heterozygous carrier of the c.919-2A>G variant,and her mother was a heterozygous carrier of the c.403C>A.

图3 前庭水管扩大患儿家系图。正方形和圆形分别代表男性和女性。Fig.3 Pedigree map of the family with EVA.Squares and cir‐cles denote males and females,respectively

c.403C>A（p.His135Asn）位于SLC26A4基因的第4外显子，导致第135位的组氨酸转变为天冬酰胺。该变异在人类基因突变数据库（http://www.hgmd.cf.ac.uk）中未曾收录，在gnomAD（http://gno‐mad.broadinstitute.org）、ExAC（http://exac.broadin‐stitute.org）、ESP（http://evs.gs.washington.edu/EVS）和千人基因组计划（http://www.1000genomes.org）等对照数据库中亦未见报道。因此，患儿及其母亲所携带的c.403C>A是SLC26A4基因新发现的变异。通过PROVEAN、PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster等多种软件预测，该变异可能会影响蛋白结构域的功能，具有潜在致病性（表1）。按照美国医学遗传学与基因组学学会（the American College of Medical Genetics and Genomics.ACMG）变异分类标准[8]，归类为“可能致病性（likely pathogenic）”变异。

表1 c.403C>A（p.His135Asn）变异的生物信息学分析结果Table 1 In silico analysis of the c.403C>A variant

3 讨论

SLC26A4基因，也称作PDS基因（pendred’s syndrome gene,PDS），位于染色体7q22-31.1，包含21个外显子[9]。其编码的Pendrin蛋白是一种含有780个氨基酸的高疏水性膜蛋白，具有12个跨膜结构域[9,10]，主要表达于内耳、甲状腺和肾脏，在液体运输、阴离子运输和维持耳蜗内电位中起着重要作用[11-13]。SLC26A4基因变异与EVA有关，扩大的前庭水管使脑脊液压力传递至内耳，进而导致耳聋的发生。EVA患者没有特定的听力水平，听力从正常到极重度聋均有可能。耳聋可以是先天性的，或者发生在出生后1-2年。听力下降模式可呈现为缓慢进展、突然加重或者波动性，但通常呈进展性。由于EVA的第三窗效应，低频听力存在气骨导差。EVA患者最初可能具备接近正常的听力，这种情况下可暂不处理。随着波动性和进展性听力下降，患者需要佩戴助听器。听力下降通常会持续进展下去，最终需要进行人工耳蜗植入[3]。

SLC26A4基因的热点变异体现出地区和种族差异。白种人中主要检测到的变异为p.L236P（c.707T>C）、p.T416P（c.1246A>C）和 IVS8+1G>A（c.1001+1G>A）[14]，南美和北美分别以 p.V609G（c.1826T>G）和 IVS8+1G>A（c.1001+1G>A）为主[15]，捷克人群中最常见的变异为p.V138F（c.412G>T）[16]，韩国人群中主要为 p.H723R（c.2168A>G）[17]，中国人群中主要为IVS7-2A>G（c.919-2A>G）和p.H723R（c.2168A>G）[18]。本研究中我们对1例非综合征性耳聋的患儿及其听力正常的父母进行了全外显子测序。先证者在SLC26A4基因中存在 c.919-2A>G（c.IVS7-2A>G）和 c.403C>A（p.His135Asn）两个变异，其中c.919-2A>G来源于父亲，c.403C>A来源于母亲。既往研究表明，c.919-2A>G属于剪接位点变异，位于第7内含子，是中国人群中SLC26A4基因最常见的致病变异[18]。本研究新发现的c.403C>A属于错义变异，位于第4外显子，根据前文生物信息学分析结果，该变异使第135位的组氨酸转变为天冬酰胺，可能会影响Pendrin蛋白结构域的功能，按照ACMG变异分类标准，归类为“可能致病性”变异。本文家系为携带者婚配，遗传方式为常染色体隐性遗传，若该家庭有再次生育意愿，孕期应进行产前诊断，以避免再次生育耳聋后代。

本研究发现了1种SLC26A4基因的新变异，扩展了中国人群中SLC26A4基因变异谱，有助于为患有EVA的耳聋患者的遗传咨询提供更多信息。