侯新星, 田如男

(南京林业大学 风景园林学院，南京 210037)

水华是由于淡水湖泊、池塘等水体中氮、磷等营养盐含量过多而造成水体富营养化引起水体中真核藻类和蓝藻快速繁殖，造成耗尽氧气供应的现象[1]，水华严重影响水体生态，造成水体发臭、渔业减产[2]。我国的太湖、巢湖、滇池等淡水湖泊在夏秋季节经常暴发水华[3-5]，其中铜绿微囊藻(Microcysticaeruginosa)为水华常见优势种[6]。物理、化学和生物技术都被用于治理水华暴发，包括机械打捞、超声波处理、化学药品沉降等方式[7]，但都存在成本代价高、破坏周围生态环境、造成二次污染等缺点，而利用植物天然化感物质抑藻效果好、无二次污染，是最具前景的控藻方式。

穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)、苦草(Vallisnerianatans)、黄菖蒲(Irispseudacorus)、芦苇(Phragmitescommunis)[8-11]等植物体内化感物质均对水华藻类生长有显著抑制作用，化感物质破坏藻类捕光系统、抑制光合电子传递并影响光合作用相关基因表达[12]；化感物质影响藻细胞膜结构，破坏膜完整性[13]；多酚类化感物质引起藻细胞内产生过量活性氧，引起细胞死亡[14]；另外，化感物质作用下，藻类呼吸作用受抑制[15]、基因转录与表达受到影响[16]。本课题组前期研究表明水生植物梭鱼草(Pontederiacordata)的种植水与其根状茎有机提取物均对铜绿微囊藻生长有强烈抑制作用[17]，并从梭鱼草根状茎中提取到多种有机酸类化感物质，其中丁二酸、香草酸与肉桂酸对铜绿微囊藻抑制作用较强。本研究选取丁二酸、香草酸与肉桂酸这3种有机酸作用于水华常见优势种铜绿微囊藻，探究丁二酸、香草酸与肉桂酸对铜绿微囊藻生长及光合色素的抑制效应的差异，以期为日后选取有机酸类化感物质抑藻提供理论基础，并从光合色素的角度揭示有机酸抑藻机理。

1 材料与方法

1.1 材料

选用的铜绿微囊藻(编号FACHB-905)，购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，采用BG-11培养基，培养条件为：光照强度(3 000±200)Lx，光暗比(12 h/12 h)，温度为(25±1)℃。培养期间每日定时摇动培养瓶2次，同时随机调换锥形瓶的位置，培养至对数生长期作为供试藻种。丁二酸、香草酸及肉桂酸标准品购自国药集团化学有限公司，均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 有机酸母液的配制

根据预实验结果，分别称取0.5、1.0、1.5和2 g的丁二酸、香草酸与肉桂酸，溶解于10 mL二甲亚砜，分别配成50、100、150和200 mg/mL的母液，4 ℃下避光保存。

1.2.2 试验设计

将处于对数生长期的铜绿微囊藻在超净工作台上接种到培养瓶，加入BG-11培养基与有机酸母液。培养体系中总体积为100 mL，取各浓度的有机酸母液40 μL，对照组加40 μL的二甲亚砜，使体系中有机酸浓度分别为0、20、40、60和80 mg/L，初始藻密度为6.75×105cells/mL。每处理重复3次。

接种当日设为第0天，自接种开始每日同一时间测定藻密度至第8天，试验的第0、2、4、6和第8天的同一时间取样测定藻叶绿素a含量及藻胆蛋白含量，试验操作均在无菌条件下进行。

1.2.3 指标测定

藻密度采取血球计数板计数法，取藻液于相差显微镜下计数，每个计数3次，取平均值。有机酸对铜绿微囊藻抑制率的计算公式为：IR=(1-Nt/Mt)×100%，式中：IR为抑制率；Nt为第t天处理组的藻密度；Mt为第t天对照组的藻密度。IR若为正值表示抑制藻生长，负值表示促进藻生长。

叶绿素a含量测定参照超声波辅助热乙醇提取法[18]，按照以下公式计算叶绿素a含量：

其中：E665a=OD665a-OD750a，E750b=OD665b-OD750b；v为提取液体积；V为样品体积。

藻胆蛋白含量测定参照Padgett等[19]的方法，并根据以下公式计算藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)与藻红蛋白(PE)的含量：

藻蓝蛋白(PC，mg/mL)=

(OD620-0.7×OD650)/7.38

别藻蓝蛋白(APC，mg/mL)=

(OD650-0.19×OD620)/5.65

藻红蛋白(PE，mg/mL)=

[OD565-2.8(PC) -1.34(APC)]/1.27

MPC=Ctreatment，PC/Ccontrol，PC×100%

MAPC=Ctreatment，APC/Ccontrol，APC×100%

MPE=Ctreatment，PE/Ccontrol，PE×100%

式中，Ctreatment为处理组不同藻胆蛋白含量，Ccontrol为对照组不同藻胆蛋白含量。

1.3 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel与SPSS 24.0统计软件进行计算与方差分析。

2 结果与分析

2.1 丁二酸、香草酸及肉桂酸对藻生长的影响

由表1中主效应对铜绿微囊藻抑制率的多重比较结果可看出，3种有机酸对铜绿微囊藻生长抑制作用排序为肉桂酸>丁二酸>香草酸，并且随着有机酸处理浓度与处理时间的增加，抑制作用加强。

表1 有机酸种类、处理时间及处理浓度主效应对藻抑制率的多重比较Table 1 Multiple comparison of the main effects of organic acid species，treatment time and treatment concentration on algae inhibition rate

由图1中交互效应对铜绿微囊藻抑制率的影响可看出，除低浓度(20 mg/L)丁二酸仅在实验初期表现为抑藻外，40、60和80 mg/L丁二酸均具有较强的抑藻效果，至第8天，其抑制率分别为51.38%、46.43%和98.63%。香草酸对铜绿微囊藻的抑制效果最差，抑制率均不超过50%。肉桂酸对铜绿微囊藻的抑制效果最强，且随着处理时间的延长，抑制作用增强，至第8天，20、40、60和80 mg/L肉桂酸对藻抑制率分别为66.76%、86.26%、92.86%和96.70%。

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。图1 处理浓度和时间交互效应对铜绿微囊藻抑制率的影响Figure 1 The interactive effect of treatment concentration and time on the inhibition rate of Microcystis aeruginosa

2.2 丁二酸、香草酸及肉桂酸对藻叶绿素a含量的影响

由表2中主效应对铜绿微囊藻叶绿素a含量影响的多重比较结果可看出，有机酸作用下，叶绿素a 含量大小排序为肉桂酸>丁二酸>香草酸，各处理组的叶绿素a含量均低于对照组，且有机酸浓度越高，叶绿素a含量越低。

表2 有机酸种类、处理时间及处理浓度主效应对藻叶绿素a含量的多重比较

由图2交互效应结果可看出，试验前期叶绿素a含量与对照组均无显著差异(P>0.05)，随着处理时间的延长，除20 mg/L丁二酸处理组藻叶绿素a含量增加，40、60和80 mg/L丁二酸处理组的叶绿素a含量始终显著低于对照组(P<0.05)，且最高浓度(80 mg/L)处理组在试验后期叶绿素a含量过低而检测不出。试验后期香草酸与肉桂酸处理组的叶绿素a含量均显著低于对照组，且浓度越高，叶绿素a含量越低。

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。图2 处理浓度与时间交互效应对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响Figure 2 The effect of the interaction between treatment concentration and time on chlorophyll a content of Microcystis aeruginosa

2.3 丁二酸、香草酸及肉桂酸对藻胆蛋白相对含量的影响

由表3中主效应对铜绿微囊藻藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)及藻红蛋白(PE)相对含量的多重比较结果可看出，PC、APC及PE相对含量均为肉桂酸>香草酸>丁二酸，随着处理时间的延长，藻胆蛋白相对含量均比第0天降低，且藻胆蛋白相对含量第4天达到最低，除20 mg/L有机酸处理组外，40 mg/L及以上处理的藻胆蛋白相对含量随着处理浓度的增加而降低。

表3 有机酸种类、处理时间及处理浓度主效应对藻胆蛋白相对含量的多重比较Table 3 Multiple comparison of the relative content of phycobiliproteinwith the main effect of organic acid species，treatment timeand treatment concentration

由图3交互效应对PC相对含量的影响可看出，丁二酸与香草酸处理下，除低浓度处理组的PC相对含量在试验初期高于对照外，随着处理时间的延长，各浓度处理的PC相对含量均低于对照组。肉桂酸处理下，第2天PC含量均较对照组减少，而试验后期各处理组的PC相对含量增加，至第8天，20、40、60和80 mg/L肉桂酸处理组的PC相对含量分别为188.07%、188.2%、134.87%和50.95%。

由图4中交互效应对铜绿微囊藻APC相对含量的多重比较结果可看出，丁二酸与香草酸处理下，APC相对含量变化趋势与PC类似，除试验初期外，其余处理组的APC含量在试验期间均比对照低。肉桂酸作用下，试验前期处理组APC相对含量均比对照组低，而试验后期低浓度处理组APC相对含量比对照组高，仅80 mg/L处理组的APC相对含量比对照组低。第8天时，20、40、60和80 mg/L肉桂酸处理组的APC相对含量分别为250.23%、238.67%、166.37%和58.99%。

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。图3 处理浓度与时间交互效应对藻蓝蛋白(PC)相对含量的影响Figure 3 The effect of the interaction between treatment concentration and time on relative content of phycocyanin (PC)

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。图4 处理浓度与时间交互效应对别藻蓝蛋白(APC)相对含量的影响Figure 4 The effect of the interaction between treatment concentration and time on the relative content of allophycocyanin (APC)

由图5中交互效应对铜绿微囊藻PE相对含量的多重比较结果可看出，除第2天时20 mg/L丁二酸处理组PE相对含量高于对照，试验后期各处理组的PE相对含量均下降，至第8天，20、40、60和80 mg/L丁二酸处理组的PE相对含量为61.72%、6.41%、13.56%和13.50%。仅高浓度香草酸处理组的PE相对含量低于对照，低浓度处理组与对照差异不显著。试验后期仅最高浓度肉桂酸处理的PE相对含量低于对照。

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。图5 处理浓度与时间交互效应对藻红蛋白(PE)相对含量的影响Figure 5 The effect of the interaction between treatment concentration and time on the relative content of phycoerythrin (PE)

3 讨论

丁二酸、香草酸与肉桂酸对铜绿微囊藻生长均有抑制作用，且随着处理浓度的增加，抑制作用越强。目前从植物体内提取化感物质应用到抑制藻类的研究很多，0.1 mg/L外来入侵植物互花米草凋落物浸提液对中肋骨条藻的抑制率达到69.2%，其主要化感物质成分为十六烷酸、亚油酸和油酸[20]；苦草种植水不同溶剂洗脱的各组分对铜绿微囊藻具不同程度的抑制作用[21]；Nakai等[22]检测出穗花狐尾藻释放到水中的4种酚酸，分别为鞣花酸、没食子酸、焦性没食子酸以及儿茶素，均对铜绿微囊藻生长具抑制作用，且没食子酸和焦性没食子酸抑制作用强于鞣花酸和儿茶素。本试验中，丁二酸、香草酸与肉桂酸对铜绿微囊藻的最大抑制率达到98.63%、48.06%和96.70%，具有较大应用前景。

3种有机酸的抑藻活性均呈现显著的剂量-效应关系，处理浓度越高，抑藻效果越好。而20 mg/L丁二酸处理对铜绿微囊藻生长表现为促进作用，可能是由于“毒物兴奋效应”引起。低剂量化感物质对微藻的生长刺激作用是普遍现象[23-24]，较低剂量的化感物质引起微藻的系列生理响应，从而抵抗化感作用。此外，化感物质的不同暴露方式也对抑藻效应产生影响。研究表明：水生植物释放的化感物质多次低剂量暴露比单次高剂量暴露有更强抑藻效果[25]，这也解释了常规毒性试验得到抑藻浓度多在mg/L水平，而实际水生植物释放到水中的化感物质在μg/L水平，可见自然环境中水生植物的化感物质释放模式与实验室中常规毒性试验的一次作用模式不同，水生植物通过多种化感物质低剂量持续释放的模式，从而实现对藻类的持续有效胁迫[26]。

藻类依靠光合作用将有机物固定在体内进行生长，光合作用是藻类生长过程中最重要的生理过程之一[27]，叶绿素a在光合作用过程中的能量捕获与传递中起着至关重要的作用[28]。研究表明：粉绿狐尾藻(Myriophyllumaquaticum)[29]与水稻浸提液[30]中的化感物质对铜绿微囊藻的叶绿素a造成破坏，凤眼莲(Eichhorniacrassipes)[31]和穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)[32]通过减少光合系统中的藻胆蛋白而对藻类整个光合系统中的能量捕获与电子传递过程进行干扰，化感物质抑制叶绿素的合成或/和加速了叶绿素的降解，从而藻胆体被破坏，叶绿素含量降低[33]。

叶绿素a是光合系统Ⅱ(PS Ⅱ)反应中心的重要功能物质，藻胆蛋白是位于藻胆体内的光合作用重要捕光天线，包括藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)与藻红蛋白(PE)3种。藻胆蛋白将捕获的光能传递到叶绿素，辅助藻细胞的光合作用[34]。当铜绿微囊藻叶绿素受损、光反应效率降低时，藻胆蛋白作为光反应的天线系统可能会通过调节组分比例来适应变化[35]。本研究中,在丁二酸、香草酸与肉桂酸作用下，除20 mg/L丁二酸处理组的叶绿素a含量在第8天增加外，其余处理组的叶绿素a含量与对照组相比均有不同程度下降，除20、40和60 mg/L肉桂酸处理组的藻胆蛋白各组分相对含量增加外，其余处理组的PC、APC及PE相对含量在试验后期均有一定程度下降，且PC与APC受损程度比PE更重。

4 结论

随着丁二酸、香草酸与肉桂酸浓度的增加，对铜绿微囊藻的抑制作用增强，3种有机酸抑藻能力从大到小排序为肉桂酸>丁二酸>香草酸；在3种有机酸作用下，铜绿微囊藻叶绿素a含量下降，藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白与藻红蛋白均受损伤，且藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白比藻红蛋白损伤程度更重，藻胆蛋白各组分比例相应发生变化。由此，丁二酸、香草酸及肉桂酸的抑藻机理可能是：有机酸直接作用于铜绿微囊藻光合系统Ⅱ反应中心，导致叶绿素a含量降低，藻胆体内的藻胆蛋白各组分受影响，光合系统受到破坏，从而抑制铜绿微囊藻生长。