邱秀芹，史崔颖，孙洪芳，王晓晓，杜佳慧，郭志刚，刘松柏

(1. 苏州卫生职业技术学院 苏州市检验医学生物技术重点实验室，苏州 215009；2. 南京师范大学 生命科学学院 江苏省分子与医学生物技术重点实验室，南京 210023)

人源分枝结构特异性内切酶-1(Flapendonuclease1,FEN1)是RAD2核酸酶家族中的一员，具有分枝结构核酸内切酶(Flap endonuclease, FEN)、5′核酸外切酶(Exonuclease, EXO)及缺口依赖核酸内切酶(Gap dependent nuclease, GEN)3种活性，DNA复制时在后随链冈崎片段成熟过程中具有不可或缺的重要功能[1-3]。在酵母菌中，敲除FEN1(Rad27)会导致菌体对DNA损伤因子(如紫外线和MMS)高度敏感[4]，而FEN1纯合敲除小鼠胚胎致死[5]。另外，将FEN1蛋白的GEN和EXO活性缺失突变体敲入小鼠基因中，导致肺癌发生比率大大增加[6]。

本课题组通过对白血病人基因组的测序，发现了FEN1基因的一种N266D杂合突变体。生物信息学分子结构分析发现，这种突变改变了FEN1蛋白的整体结构，影响了FEN1与DNA底物的亲和性，并可能对其活性产生影响[7]。

本研究构建FEN1突变体N266D的表达载体，表达纯化N266D蛋白。通过研究N266D的核酸酶活性变化情况及对细胞增殖产生的影响，从而探讨FEN1突变体N266D在疾病发生进展中的潜在功能，为进一步阐述FEN1突变与肿瘤发生、治疗之间的关系提供了坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

细胞株：人胚肾上皮细胞系293T细胞，本实验构建的FEN1-WT在PET28载体及M12载体的两个质粒。

1.2 主要试剂和仪器设备

DMEM培养基购自Gbio；胎牛血清购自SERANA，胰酶均购自Hy-Clone公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen；LB培养基购自索莱宝；质粒提取试剂盒购自天根；蛋白纯化试剂盒购自碧云天；引物及活性检测底物oligo由金斯瑞公司合成；……