郑雅婷，李 翔，王鹏程，杨艳坤，白仲虎

(江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 214122)

毕赤酵母(Pichiapastoris)是一种广泛应用于异源蛋白质生产的宿主[1]，具有高密度生长和高蛋白质分泌能力等优点[2]。毕赤酵母高效表达外源蛋白的关键是甲醇代谢通路(methanol utilization pathway，MUT)，该通路中醇氧化酶对其底物的亲和力很低，所以需要大量酶以维持细胞在甲醇上的生长，特别是第一种限速酶Aox1(Alcohol oxidase 1, 醇氧化酶1)[3-4]。Aox1约占总mRNA的5%，占可溶性蛋白的30%[2]。据报道，细胞生长在抑制碳源上(甘油等)时缺乏Aox1活性[5]，且细胞中无法检测到Aox1的mRNA，所以这种严格的调控主要作用于转录水平[6-8]。

通过前期研究，发现PAS_chr1-4_0516(与酿酒酵母中的sterol uptake 2, 即Sut2基因同源)等基因的表达可积极响应碳源变化，并在甲醇中有更高的表达量[9]。据报道，Sut2是Zn2Cys6家族的潜在转录因子[10-11]，推测在毕赤酵母中，该基因可能对甲醇代谢具有调控作用。有研究发现，酿酒酵母中Sut2在厌氧条件下与Sut1一起调节麦角固醇的摄取，并参与麦角固醇的生物合成[12]，而毕赤酵母中不具有同源基因Sut1。据报道，麦角固醇是酵母细胞膜及过氧化物酶体膜的主要成分[13]，毕赤酵母中麦角固醇的合成与转运机制尚不清楚。

为表征Sut2在毕赤酵母中的功能，在毕赤酵母中分别过表达和敲除Sut2，研究Sut2与MUT之间的相关性，通过添加甲醇及其代谢物来探究Sut2的诱导剂，并研究Sut2功能与麦角固醇的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和试剂

毕赤酵母GS115和载体pUC19、pMD19-T、pPICZ B均为本实验室保存。限制性内切酶和T4 DNA ligase均购自Thermo Fisher Scientific；2×PfuMasterMix、2×TaqMasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；质粒小量试剂盒、PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自AXYGEN;DNA分子量Marker、反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和荧光定量试剂盒SYBR®PremixExTaqTMII购自TaKaRa;Ampicillin购自上海生工；Zeocin购自美国Invitrogen公司；酵母浸出物、蛋白胨购自英国OXOID公司。文中所涉及的引物列于表1。

表1 本研究所用的引物序列

1.2 方法

1.2.1Sut2敲除菌株构建

用基因组DNA作模板，PCR扩增Sut2上游Sut2-up(0.6 kb)。并以质粒pMD19-T-GT1-del(实验室前期构建)作模板，PCR扩增Kan基因及其启动子和终止子(1 556 bp)。用相应的内切酶切Sut2-up和Kan，然后将产物与用Hind III/SmaI双酶切的pUC19载体连接，获得重组质粒pUC19-Sut2up-Kan。PCR扩增Sut2下游Sut2-down(0.6 kb)，将SmaI/SacⅠ酶切的基因片段和pUC19-Sut2up-kan载体连接，得到质粒pUC19-Sut2-del。以pUC19-Sut2-del为模板，PCR扩增得到Sut2敲除片段，将其电转化GS115，以0.3 mg/mL G418筛选抗性转化子，流程如图1。

图1 Sut2敲除片段构建Figure 1 The construction of Sut2-knockout sequence

1.2.2Sut2过表达菌株构建

以GS115基因组DNA为模板，PCR扩增得到Sut2片段(1 kb)。再经EcoR I/XhoI双酶切，连接至载体pGAPZ B中，转化感受态DH5α，得到重组质粒pGAPZB-Sut2。AvrII单酶切线性化pGAPZB-Sut2，电转化GS115，获得Sut2过表达菌株GS115-Sut2，流程如图2。

图2 Sut2过表达载体构建Figure 2 The construction of Sut2 overexpression plasmid

1.2.3 麦角固醇水平检测

YPD活化后的菌株以初始OD600为0.5转接基本培养基MM(1.34% YNB，0.004% histidine, 4×10-5% biotin，1% methanol)。对数末期取样，4 ℃、3 000 r/min离心5 min，上清液和菌体分开处理。上清液用甲醇稀释10倍，震荡10 min，翻转混匀5 min，离心后取200 μL以检测上清液中麦角固醇含量。菌体用双蒸水洗涤2次，然后使用冻干机将酵母细胞在-80 ℃下冷冻干燥，取10 mg悬浮于甲醇∶1-丙醇(体积比1∶1)溶液中，用Ultra Turrax匀浆仪(IKA, Staufen, Germany)匀浆5 min，离心后将上清液转移至样品瓶中以检测胞内麦角固醇含量。通过HPLC分析样品，使用SYMMETRY C18，4.6×250 mm柱(Waters，MA，USA)，用流速为0.8 mL/min的甲醇作流动相，在30 ℃下进行检测。

1.2.4Aox1SDS-PAGE和酶活检测

将菌株接种于5 mL YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)培养基中，30 ℃，230 r/min摇床培养过夜活化。离心收集菌体，以BMGY(10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 3 g/L K2HPO4, 11.8 g/L KH2PO4, 13.4 g/L YNB, 4×10-4g/L biotin,2.5 mL/L glycerol)培养基重悬至OD600为0.2进行培养，22 h补加甲醇至终浓度为10 mL/L，培养45 h，检测10、22、35和45 h时菌株Aox1表达量。每个时间点取1 mL菌液，稀释至OD600为3.0，取1 mL菌液离心5 min后弃上清液；加入 0.5 mL细胞裂解液悬浮细胞，再加入0.3 g 425～600 μm玻璃珠振荡30 s，于冰上放置 1 min，重复10次；4 000 r/min离心5 min，取上清液进行SDS-PAGE实验，具体参见文献[14]。另取部分上清液，在酶标板中加入100 μL醇氧化酶检测溶液，加入上清液5 μL；再加3 μL甲醇，室温反应15～30 min，最后加20 μL 2 mol/L硫酸(含0.1 mol/L亚硫酸钠)终止反应，并于492 nm测量吸光度。

1.2.5 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)

用GeneJet RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)的标准方法提取总RNA，按照HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR(诺唯赞，中国南京)标准方法进行反转录。将得到的cDNA按照ChanQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，中国南京)标准方法进行荧光定量PCR。

2 结果与分析

2.1 GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株中Aox1的转录与翻译水平检测

通过PCR分析Sut2敲除质粒，电泳结果见图3(a)，与预期大小2.7 kb相符。用于Sut2过表达菌株构建的pGAPZ B和Sut2片段的双酶切结果见图3(b)，与预期大小2.8 kb和1 kb相符。重组菌株的PCR鉴定结果见图3(c)，与预期大小1.2 kb相符，且测序验证正确。

(a)M：DL10k Marker；1～12：Sut2敲除质粒PCR产物(2.7 kb)。(b)M: DL10k Marker；1：pGAPZ B双酶切(2.8 kb)；2：Sut2双酶切(1 kb)。(c)M: DL5k Marker；1～6：Sut2过表达菌株基因组PCR产物(1.2 kb)。图3 Sut2敲除与过表达的PCR鉴定Figure 3 PCR results for knock-out and overexpression of Sut2

将GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株活化后，用BMMY(10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 3 g/L K2HPO4, 11.8 g/L KH2PO4, 13.4 g/L YNB, 4×10-4g/L biotin, 10 mL/L methanol)培养基进行培养，在对数末期取样，通过RT-qPCR检测Sut2和Aox1的转录水平。通过验证GS115-ΔSut2和GS115-Sut2，分别实现Sut2的敲除和过表达，见图4(a)。GS115-ΔSut2菌株中Aox1的转录水平比野生型低约22%，GS115-Sut2菌株的Aox1转录水平比野生型高约13%，见图4(b)。

(a) Aox1的转录水平； (b) Sut2的转录水平(对照为甲醇中的GS115菌株，*为P<0.05)。图6 RT-qPCR 检测Aox1和Sut2在不同诱导剂条件下的表达Figure 6 Detection of Aox1 and Sut2 expression with different inducers by RT-qPCR

(a) Sut2的转录水平;(b) Aox1的转录水平。图4 RT-qPCR 检测Sut2和Aox1在不同菌株中的表达Figure 4 Detection of Sut2 and Aox1expression in different strains by RT-qPCR

检测GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株中Aox1蛋白的表达量，结果发现：经甲醇诱导后，过表达Sut2菌株的Aox1酶活最高，缺陷型与野生型的Aox1酶活相近(图5)。以各菌株最高表达量为例(45 h)，GS115-Sut2酶活较野生型高约17%，GS115-ΔSut2较野生型高约6%；而以甘油为唯一碳源时，各菌株的Aox1酶活相对较低，且无明显差异。

结合图4和图5可知：过表达Sut2可提高Aox1的转录与翻译水平；Sut2的敲除会导致Aox1转录水平的降低，而Aox1翻译水平无明显下降，这可能是翻译过程中存在的其他因素综合调控的结果。由此表明，Sut2可能对Aox1的转录水平存在一定程度的正调控。

图5 不同菌株摇瓶培养不同时间取样检测Aox1酶活Figure 5 Enzyme activities of Aox1 fermentation in different strains at different time

2.2 不同碳源对Sut2表达的影响

P.pastorisAox1是MUT途径的首步酶和限速酶，主要作用是将甲醇氧化为甲醛以及过氧化氢，从而启动甲醇代谢过程[15]。为探究MUT途径中诱导Sut2表达的具体物质，将GS115和GS115-ΔAox1菌株(实验室前期构建，方法类似于GS115-ΔSut2的构建)活化后，以BMY(配方为上文所述的BMMY培养基不加甲醇)培养基加6 mmol/L甲醇或甲醛为碳源对其进行培养。检测Sut2和Aox1基因的转录水平，从而进一步确定Sut2表达的诱导剂。结果发现：在GS115和GS115-ΔAox1菌株中，碳源为甲醇时Sut2的转录水平比甲醛中分别高约5.7和4.2倍(图6)。

2.3 GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株中麦角固醇含量检测

将GS115-ΔSut2、GS115-Sut2和GS115菌株活化后，用基本培养基进行培养，利用HPLC检测细胞内外麦角固醇的含量。如图7所示，随着Sut2表达量的提高，胞内麦角固醇含量具有5%～10%的提高，而胞外麦角固醇含量具有30%～40%的提高。

(a)胞内麦角固醇含量;(b)胞外麦角固醇含量(以GS115菌株为对照，*为P<0.05)。图7 HPLC检测细胞内外麦角固醇含量Figure 7 Detection of intracellular and extracellular ergosterol by HPLC

3 讨论与结论

基于毕赤酵母转录组数据[9]可推断，潜在转录因子Sut2可能参与了甲醇代谢通路，然而具体机制尚不清楚。据报道，ScSut1是Zn2Cys6锌指蛋白家族之一，其上调能促进有氧条件下外源甾醇的摄取和胞内甾醇的生物合成。研究表明，结构相关基因YPR009(Sut2)是Sut1的功能同系物[12]。

为研究Sut2是否对Aox1有调节作用，通过敲除和过表达Sut2，检测不同菌株中Aox1的转录和翻译水平。结果表明:Sut2对Aox1有一定程度的正调控作用，且这一调控很可能发生在转录水平。在甲醇及其代谢物对Sut2的诱导实验中发现，甲醇对GS115和GS115-ΔAox1菌株的诱导作用均显著高于甲醛，这可能是培养环境中甲醛的存在，使细胞不需要大量的醇氧化酶，从而导致Aox1和Sut2在甲醛中低表达。野生型菌株中Sut2与Aox1的转录水平变化非常相似，结合Aox1的表达受甲醇诱导可知，甲醇是Sut2表达的主要诱导剂。另一方面，通过麦角固醇检测实验发现，细胞内外麦角固醇含量与Sut2呈正相关。由于基本培养基中不含有麦角固醇，因此细胞内外的麦角固醇均来自菌体自身合成。由此可推测，毕赤酵母中Sut2可能参与调控麦角固醇的合成。据报道，麦角固醇是毕赤酵母过氧化物酶体膜上的重要组成成分，是过氧化物酶体增生所必需的结构原材料[16];而过氧化物酶体是甲醇代谢的主要场所，在甲醇为唯一碳源的时候，毕赤酵母中的过氧化物酶体会急剧增生，这是甲醇代谢的重要特征之一[2]。因此推测Sut2可能通过调控麦角固醇的合成来参与甲醇代谢，这一假设有待进一步在体内体外实验验证。

研究发现并初步鉴定毕赤酵母甲醇利用途径有关的新基因Sut2，它是一个潜在转录因子。Sut2的表达可以被甲醇(及其氧化过程)诱导，且在一定程度上正向调控Aox1的表达，其中的机制有待进一步研究。另外，发现Sut2基因的功能与麦角固醇合成的联系，这为解析甲醇代谢通路奠定了基础。