郑雅婷，李 翔，王鹏程，杨艳坤，白仲虎

(江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 214122)

毕赤酵母(Pichiapastoris)是一种广泛应用于异源蛋白质生产的宿主[1]，具有高密度生长和高蛋白质分泌能力等优点[2]。毕赤酵母高效表达外源蛋白的关键是甲醇代谢通路(methanol utilization pathway，MUT)，该通路中醇氧化酶对其底物的亲和力很低，所以需要大量酶以维持细胞在甲醇上的生长，特别是第一种限速酶Aox1(Alcohol oxidase 1, 醇氧化酶1)[3-4]。Aox1约占总mRNA的5%，占可溶性蛋白的30%[2]。据报道，细胞生长在抑制碳源上(甘油等)时缺乏Aox1活性[5]，且细胞中无法检测到Aox1的mRNA，所以这种严格的调控主要作用于转录水平[6-8]。

通过前期研究，发现PAS_chr1-4_0516(与酿酒酵母中的sterol uptake 2, 即Sut2基因同源)等基因的表达可积极响应碳源变化，并在甲醇中有更高的表达量[9]。据报道，Sut2是Zn2Cys6家族的潜在转录因子[10-11]，推测在毕赤酵母中，该基因可能对甲醇代谢具有调控作用。有研究发现，酿酒酵母中Sut2在厌氧条件下与Sut1一起调节麦角固醇的摄取，并参与麦角固醇的生物合成[12]，而毕赤酵母中不具有同源基因Sut1。据报道，麦角固醇是酵母细胞膜及过氧化物酶体膜的主要成分[13]，毕赤酵母中麦角固醇的合成与转运机制尚不清楚。

为表征Sut2在毕赤酵母中的功能，在毕赤酵母中分别过表达和敲除Sut2，研究Sut2与MUT之间的相关性，通过添加甲醇及其代谢物来探究Sut2的诱导剂，并研究Sut2功能与麦角固醇的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和试剂

毕赤酵母GS115和载体pUC19、pMD19-T、pPICZ B均为本实验室保存。限制性内切酶和T4 DNA ligase均购自Thermo Fisher Scientific；2×PfuMasterMix、2×TaqMasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；……