李伟博，韩佳欣，何洋，周静，纪丽莲，胡卫成

1.新疆农业大学食品科学与药学学院（乌鲁木齐 830052）；2.淮阴师范学院生命科学学院，江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室（淮安 223300）

藏药密生波罗花（Incarvillra compacta）为紫葳科角蒿属植物，是中国特有的草本植物[1]。其主要生长于海拔在2600～4100 m的甘肃南部、青海、西藏等地，与两头毛和西藏罗花共同作为传统药材“欧曲”，其花、根、种子均可入药，主要治疗高血压、月经不调、胃痛、黄疸、消化不良，具有阵痛功效[2-3]。密生波罗花主要生长于空旷石砾山坡及草灌丛中，具有很强的滋补作用，常被当地人作为一种养身的保健药材来食用。

目前为止，有关密生波罗花的研究主要集中在其化学成分及药理活性方面。密生波罗花主要的化学成分包括单萜生物碱、环己乙醇、神经酰胺、香豆素和苯乙醇苷类等[4-5]。但目前还未见有关密生波罗花营养成分的报道。

此次试验对密生波罗花的营养成分和体外抗氧化活性进行基础研究，为保护和合理开发利用我国这一民族药用植物资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

密生波罗花，青海省西宁市药材市场经干燥的整株花；福林酚，索莱宝公司；㗷唑蓝（MTT），赛国生物科技；二苯基苦味酰基苯肼（DPPH）、没食子酸、生育酚、1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+），均为分析纯，SIGMA公司；槲皮素、石油醚、无水乙醇、丙酮、硫酸、氢氧化钠、盐酸、乙醚、氢氧化钾、无水硫酸铜、亚硝酸钠、硝酸铝、无水碳酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁，均为分析纯，国药集团。

1.2 仪器与设备

BS224分析天平，北京多利斯仪器系统有限公司；5810R台式高速离心机，德国Eppendorf公司；DI-220/KD-310全自动凯氏定氮仪，瑞典Opsis公司；RE-3000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；Infinite M200 Pro酶标仪，瑞士Tecan；DK-8BD电热恒温水槽，上海精宏试验设备有限公司；日立L8900氨基酸分析仪，日本日立公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

将密生波罗花在60 ℃干燥箱中干燥4 h，经粉碎机粉碎后过1 mm筛，放至干燥处保存，备用。

1.3.2 营养成分的测定方法

总糖的测定方法参照SN/T 4260—2015[6]，使用苯酚硫酸法测定；粗脂肪的测定参照GB/T 5009.6—2016[7]，使用索氏提取法；粗纤维的测定参照GB 5009.10—2003[8]，使用植物类粗纤维含量的测定方法；粗蛋白的测定参照GB/T 6432—2018[9]，使用凯氏定氮法测定；水分的测定参照GB/T 5009.3—2016[10]，使用直接干燥法测定；灰分的测定参照GB 2019.4—2016[11]，使用高温灼烧法测定；氨基酸的测定参照GB 5009.124—2016[12]，使用日立L8900氨基酸分析仪测定。

1.3.3 乙醇提取物和水提取物的制备

精确称取5 g密生波罗花粉末，以料液比1∶20（g/mL）的比例分别加入水和70%乙醇，在90 ℃水浴锅中加热3 h，过滤，旋蒸，冷冻干燥，分别获得70%乙醇提取物和水提取物，放置干燥器中备用。

1.3.4 黄酮的测定

将0.3 mL 3%的NaNO2加入0.5 mL 80%乙醇，配制不同质量浓度的槲皮素标准溶液（0，25，50，100，200，300，400和500 μg/mL），混匀，避光静置5 min，然后加入0.3 mL 10% Al(NO3)2和2 mL 4% NaOH，混匀，室温静置15 min后在510 nm处测其吸光度，重复3次。建立标准曲线，根据槲皮素的标准曲线，测得密生波罗花中黄酮的含量。

1.3.5 Fe3+能力的测定

参照景临林等[13]方法，分别称取10 mg密生波罗花的两种提取物，用甲醇配制成0.25，0.5，1，1.5和2 mg/mL的溶液。分别取0.2 mL上述溶液，加入0.5 mL 0.2 mmol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液和0.5 mL 1%的铁氰化钾，涡旋混匀，于50 ℃孵育30 min，在冰上冷却，加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，涡旋混匀。取0.5 mL，加入0.5 mL纯水和0.1 mL 1%的三氯化铁，涡旋混匀，各取0.2 mL加入96孔板，重复3次，以VE作为标准参照物，用酶标仪在700 nm处测定吸光度。吸光度越大表示铁还原能力越强。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的测定

参照张良等[14]方法，精确称取7.88 mg DPPH溶于100 mL甲醇溶液中，得到0.2 mmol/L的DPPH溶液。分别取0.1 mL不同质量浓度的受试物（50，100，200，400和600 μg/mL）和0.1 mL DPPH加入96孔板中。按照上述方法，将DPPH与甲醇混合作为对照组，不同浓度的样品液与甲醇混合作为空白组。以VE作为标准参照物，避光反应30 min，使用酶标仪在517 nm处测得吸光度。DPPH自由基清除率按式（1）计算。

式中：A1为DPPH甲醇溶液与甲醇溶液混合后的吸光度；A2为待测液与甲醇溶液混合后的吸光度；A3为DPPH甲醇溶液与甲醇混合后的吸光度。

1.3.7 MTT法检测密生波罗花抗氧化应激能力

将PC12细胞接种于DMEM培养基中，在37 ℃，5%的CO2培养箱中培养，取适量对数生长期的PC12细胞，以3×105接种进96孔板，待细胞长至70%～80%，分别用乙醇提取物和水提取物以不同的质量浓度（12.5，25，50和100 μg/mL）处理细胞30 min，然后加入MPP+诱导细胞24 h，加入0.05 mL 1 mg/mL的MTT溶液，继续培养2 h，吸去上清液，每孔加入0.1 mL异丙醇，振荡10 min使紫色结晶充分溶解，在570 nm处测其吸光度。

1.4 数据统计分析

数据分析均使用Origin 8.0，SPSS 23软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 密生波罗花中的营养成分

由表1可知，密生波罗花中粗脂肪为5.33±1.15 g/100 g；粗蛋白为14.36±0.28 g/100 g；粗纤维为66.01±1.8 g/100 g；粗灰分为2.3±0.14 g/100 g；粗水分为4.88±0.3 g/100 g；总糖为1.77±0.09 g/100 g。

表1 密生波罗花中营养成分表

2.2 密生波罗花中氨基酸成分和质量分数的分析

由表2可知，密生波罗花中共含有17种氨基酸，总氨基酸质量分数为7.28%，其中必需氨基酸（EAA）共7种，质量分数为2.84 g/100 g，占总氨基酸（TAA）的39%；非必需氨基酸（NEAA）共10种，质量分数为4.442 g/100 g，占总氨基酸（TAA）的61%，EAA/NEAA为64%，均接近于FAO/WHO所推荐的EAA/TAA约为40%，EAA/NEAA约为60%的要求。

表2 密生波罗花中氨基酸含量

密生波罗花中药用氨基酸共11种，质量分数为5.27 g/100 g，占总氨基酸（TAA）的72%。鲜味氨基酸共4种，质量分数为2.311 g/100 g，占总氨基酸的32%。其中谷氨酸最高，为1.044 g/10 g，占总氨基酸的14%，不仅为人类和动物提供了重要的营养物质，还可以和氨反应增加还原型谷胱甘肽的生成，促进抗氧化作用[16]。

2.3 呈味氨基酸分析

密生波罗花中呈味氨基酸分析见图1。密生波罗花中谷氨酸和天冬氨酸总的质量分数为1.643 g/100 g，占总氨基酸的22.56%。谷氨酸呈酸性，天冬氨酸呈甜性，它们能很好地调和其他滋味，从而使药物体现出微苦、微甘的口感。

图1 密生波罗花中呈味氨基酸分析

2.4 密生波罗花中抗氧化活性的研究

2.4.1 密生波罗花中总黄酮的测定

密生波罗花总黄酮标准曲线方程为Y=0.0013X-0.0039（R2=0.9987），测得密生波罗花中总黄酮质量分数为6.78 g/100 g。

2.4.2 乙醇提取物和水提取物的制备

乙醇提取物和水提取物的得率如表3所示。结果表明，水提取物的得率明显高于70%乙醇提取物的得率。

表3 密生波罗花提取物的得率

2.4.3 DPPH清除能力的测定[17]

如图2所示，在相同提取条件不同提取溶液中，当质量浓度达到600 μg/mL时，乙醇提取物和水提取物对DPPH的清除能力基本一致，略高于VE对DPPH自由基的清除能力并且随着浓度的增加保持稳定状态。由此表明密生波罗花具有一定的DPPH自由基清除能力。

图2 密生波罗花对DPPH自由基清除率

2.4.4 Fe3+还原能力的测定[18]

如图3所示，随着密生波罗花中提取物浓度的增加，其吸光度也呈上升趋势。当乙醇提取物为1.5 mg时，与0.4 mg的VE的还原能力相同；当水提取物为0.25 mg时，与0.05 mg的VE的还原能力相同，由此表明密生波罗花具备一定的还原能力。

图3 密生波罗花对Fe3+还原能力的测定

2.4.5 密生波罗花对MPP+诱导PC12细胞氧自由基损伤修复能力测定[19]

如图4所示，与MPP+诱导组相比，低浓度的密生波罗花提取物处理组细胞存活率明显升高。结果表明，密生波罗花能抑制MPP+诱导的PC12细胞损伤，具有一定的氧自由基修复能力。

图4 密生波罗花对MPP+诱导PC12细胞氧自由基损伤修复能力测定

3 讨论与结论

密生波罗花中营养成分含量较为丰富，其中粗蛋白、粗纤维含量较高，蛋白质是一切生命的物质基础，缺少蛋白质可导致人体免疫力下降，粗纤维可以改善肠道蠕动，有助于人体肠道的消化。氨基酸含量的测定，体现出药材的质量[20]，也是其营养价值的重要组成部分。密生波罗花中氨基酸成分比较全面，其中必须氨基酸占总氨基酸的39%，药效氨基酸占总氨基酸的72%。呈味氨基酸所呈现的酸甜味，可以掩盖其他的不良风味。

密生波罗花中水提取物的得率大于乙醇提取物的得率，可能是因为不同的提取溶剂造成的差异。氧自由基是人体代谢的产物，可造成生物膜系统损伤以及细胞内氧化磷酸化障碍，与人体疾病、衰老、死亡密切相关[21]。密生波罗花具有较好的抗氧化活性，密生波罗花中乙醇提取物和水提取物对DPPH自由基的IC50分别为93.1和184.13 μg/mL，0.25 mg的水提取物还原力相当于0.05 mg VE的还原能力，1.5 mg的乙醇提取物还原能力相当于0.4 mg VE的还原能力。随着浓度的升高，乙醇提取物的抗氧化能力高于水提取物的抗氧化能力，可能是因为乙醇提取物中黄酮的含量比较高。Chavan等[22]的研究表明，黄酮是大多数植物提取物抗氧化的物质基础，密生波罗花中黄酮含量比较丰富，可能是其发挥抗氧化的物质基础，具体的化合物成分需要进一步的研究。

1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）是一种作为氧化应激的诱导剂，可引起PC12细胞氧自由基损伤[23]。密生波罗花乙醇提取物和水提取物在低浓度时表现出明显的对MPP+引起的PC12细胞氧自由基损伤修复作用，但水提取物明显高于乙醇提取物的氧自由基修复能力，可能是因为密生波罗花乙醇提取物的提取温度过高造成的。薛长晖等[24]研究表明，提取液在提取过程中反应温度过高会导致黄酮变质。结合抗氧化活性可以得出，密生波罗花提取物可通过两种途径对MPP+诱导PC12细胞造成的氧自由基损伤进行修复：一是直接清除氧自由基，减少自由基对蛋白、脂质、DNA的损伤；二是通过对细胞内抗氧化能力的改善和修复。

此次试验对密生波罗花中营养成分、氨基酸及体外抗氧化活性进行了测定，结果表明，密生波罗花中营养成分丰富且氨基酸种类齐全，具有很好的抗氧化活性，而抗氧化活性是保健品的重要组成部分[25]。此次试验为密生波罗花作为天然抗氧化剂用于保健品的开发利用指明了道路。