王逸博，孙海鹰

（中国药科大学药学院药物化学系，江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室，江苏 南京 210009）

1 凋亡抑制蛋白的结构与功能

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是一类高度保守的内源性抑制细胞凋亡的蛋白家族，在昆虫、酵母和哺乳动物等中广泛存在[1]。目前在人体中发现的IAPs共有8种，包括NIAP、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、Survivin、BRUCE、MLIAP和ILP2[2]。IAPs蛋白家族的结构特征是氮端含有1 ～ 3个包含70个氨基酸的杆状病毒IAP重复序列（baculoviral IAP repeat，BIR)，即BIR结构域。BIR结构域是绝大多数IAPs的抗凋亡活性所必须的，不同BIR结构域具有一定的同源性，但功能却各不相同[3]。IAPs主要通过直接或间接地抑制半胱天冬酶（Caspases）的活性或参与调节核因子κB（NF-κB）的功能来抑制细胞凋亡，抑制IAPs可以诱导细胞凋亡或增加细胞死亡的阈值[4]。在IAPs中被研究最多的是XIAP、c-IAP1和c-IAP2，它们均含有3个BIR结构域（见图1）。XIAP的BIR3结构域可以结合并抑制Caspase-9，而XIAP的BIR2结构域和BIR1与BIR2之间的肽链可以结合并抑制 Caspase-3和 Caspase-7[5]。c-IAP1和 c-IAP2也可以通过它们的BIR3结构域与Caspase-9结合，但不能抑制Caspase-9的活性，它们主要通过抑制Caspase-8的激活来抑制细胞凋亡的发生[6-8]。XIAP、c-IAP1和c-IAP2在很多肿瘤中过度表达，而且其过度表达与肿瘤的发展和抗药性的产生密切相关，因此它们被认为是研发新型抗肿瘤药物的 靶点[9-12]。

2 Smac的功能及其与IAPs的相互作用

Smac是线粒体接收到凋亡信号后释放出的一种蛋白，它是细胞中IAPs的内在调节剂。Smac可以通过其氮端的四肽AVPI（Ala-Val-Pro-Ile）与IAPs的BIR结构域结合，因此Smac氮端的四肽AVPI被称为IAP结合单元（IAP binding motif，IBM）。当Smac与XIAP结合时先形成二聚体，二聚体中的2个AVPI四肽单元分别与XIAP的BIR2和BIR3结合。Smac与XIAP的结合可以直接抑制XIAP与Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的结合，从而恢复Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的功能，促使凋亡发生。当Smac与c-IAP1和c-IAP2结合时只与这2种IAPs的BIR3结合。Smac与c-IAP1和c-IAP2结合后会诱导它们降解，从而间接促使Caspase-8的激活[9-12]。

目前已有多个以XIAP、c-IAP1和c-IAP2为靶点的小分子IAPs抑制剂进入临床研究，其中大部分都是以四肽AVPI为先导化合物设计的BIR3选择性泛IAPs抑制剂，即这些化合物可以与XIAP、c-IAP1和c-IAP2的BIR3结构域有效结合[13]。另外，基于BIR3选择性IAPs抑制剂已有很多报道，其中部分化合物已经进入临床研究[13-14]。对BIR2选择性IAPs抑制剂的研究相对较少，但近年来随着对IAPs作用机制的深入研究，对BIR2选择性IAPs抑制剂的研究也引起了越来越多药物化学家们的关注。BIR2选择性IAPs抑制剂可以阻断XIAP与Caspase-3和Caspase-7 的相互作用，但不会使c-IAP1和c-IAP2 降解，也不会引起因c-IAP1和c-IAP2降解导致的非经典NF-κB通路的激活，其功能与BIR3选择性IAPs抑制剂完全不同，因此是一类新型的IAPs抑制剂，不仅可以作为药物进行研发，也可以作为小分子工具用于相关的生物学机制研究。

3 BIR2选择性IAPs抑制剂

3.1 早期通过高通量筛选得到的BIR2选择性IAPs抑制剂

对BIR2选择性的XIAP抑制剂的研究最早可追溯至2003年。Tamm等[15]利用噬菌体展示技术发现一个通过二硫键环合的六肽CEFESC（Cys-Glu-Phe-Glu-Ser-Cys）可以特异性地与XIAP的BIR2结构域相结合，但跟其他IAPs没有结合作用。Caspase-3和Caspase-7可抑制该六肽CEFESC与XIAP的结合，但Caspase-8不具备该功能，表明该六肽是靶向XIAP中与Caspase-3和Caspase-7结合的区域，但该六肽与XIAP的具体结合模式尚不清楚。

2003年Wu等[16]通过高通量筛选的方法对一个包含160 000个小分子化合物的化合物库进行了筛选，成功发现了一系列非肽类的小分子磺酰胺类化合物，这类化合物通过与XIAP中的linker-BIR2区域结合，竞争性地解除XIAP对Caspase-3的抑制作用，其中化合物1结合的IC50为10 μmol·L-1。这类化合物可以诱导293细胞系的凋亡，并且增强CD95和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）诱导凋亡的能力。

2004年Shimmer等[17]通过对包含近1×108个肽类及非肽类化合物的化合物库进行高通量筛选，发现了一系列多苯基脲类BIR2选择性XIAP抑制剂，其中活性最强的是化合物2。该化合物可以特异性与XIAP的BIR2结构域结合并恢复Caspase-3的活性，而且可以直接诱导多种肿瘤细胞凋亡。在异种移植的小鼠模型中该化合物可以抑制肿瘤组织的生长并增加肿瘤对化疗药物的敏感性。

3.2 以多肽为先导化合物设计的BIR2选择性IAPs抑制剂

虽然以往研究中通过高通量筛选发现了一些BIR2选择性XIAP抑制剂，但这些化合物与XIAP-BIR2的结合能力通常不强，而且结合模式也不确定，因此多个课题组采用与BIR3选择性IAPs抑制剂的研发中类似的方式，以Smac氮端的四肽AVPI为先导化合物，对BIR2选择性IAPs抑制剂进行研究。

四肽AVPI既可以与XIAP的BIR2结构域结合，也可以与XIAP的BIR3结构域结合，但它与BIR3的结合能力强于与BIR2的结合能力。2006年Sweeney等[18]用不同的天然氨基酸对AVPI中各个位置的氨基酸分别进行替换，合成了一系列四肽，并研究了四肽与XIAP的BIR2结构域结合的构效关系。结果表明，为了保持与XIAP-BIR2的结合能力，P1位置只能选Ala；P2位置倾向于β位带有支链的疏水性氨基酸，如Val、Thr、Ile等，或者是既含有疏水性，又含有亲水性片段的氨基酸，如Gln、Glu、Lys、Arg、Tyr等；P3位置倾向于含有小的侧链的氨基酸，如Ala、Ser、Val等；P4位置也倾向于带有较小侧链的氨基酸，如Gly、Ala、Thr、Val等。

2013年Lukacs等[19]对Sweeney等[18]的研究结果进行了确证，发现与BIR2结合能力最强且选择性最高的四肽是ATAA（Ala-Thr-Ala-Ala），该四肽ATAA与XIAP的BIR2结合的抑制常数Ki为1.7 μmol·L-1，比 Smac 氮 端 的 四肽 AVPI与 XIAP 的BIR2 的结合能力强 3 倍（Ki= 5.2 μmol·L-1）。更重要的是，Lukacs等[19]还解析了5个四肽与XIAP的BIR2形成的复合物的晶体结构，分别是ATAA 复合物（PDB ID：4j45）、AIAV 复合物（PDB ID：4j44）、AVPI 复合物（PDB ID：4j46）、SVPI 复合 物（PDB ID：4j47） 和AMRV 复 合 物（PDB ID：4j48），从而从结构生物学的角度证实了这些四肽与XIAP的BIR2结构域的结合模式。虽然这些四肽与XIAP-BIR2的结合能力有差异，但它们与XIAP-BIR2的结合模式基本一致。比较AVPI与XIAP-BIR2和XIAP-BIR3形成的复合物的晶体结构可以发现，BIR2和BIR3中3个关键位置的氨基酸残基的不同显著影响了它们与四肽的结合，这3个位置的氨基酸残基分别是His223/Trp323、Phe224/Tyr324和Lys206+Lys208/Gly306+Thr308（见图2）。四肽中P3位置的氨基酸残基可以与His223/Trp323和Phe224/Tyr324结合。His223中的侧链比Trp323中的侧链小，因此BIR2与四肽中P3位置的氨基酸残基的疏水性作用弱于BIR3。同样因为His223中的侧链小于Trp323，His323与Phe224之间的空腔比Trp223与Tyr324间的空腔大，而且Tyr324中的羟基可以与BIR3中的Gly306的羰基形成氢键，使蛋白构象具有更强的刚性，所以与BIR2结合时四肽的P3位置可以是较大的不同基团，而与BIR3结合时P3位置只能是Pro。在XIAP-BIR2中Lys206和Lys208的侧链及其下方的Gln197的侧链形成了一个较浅的口袋与四肽中P4位置的氨基酸残基的侧链结合，而在XIAP-BIR3中对应于Lys206和Lys208的分别是Gly306和Thr308，这2个残基与P4位置的氨基酸侧链结合较弱，P4位置的氨基酸侧链主要是与其下方由Lys297、Lys299及Leu292形成的一个较大的疏水性口袋结合，因此XIAP-BIR3中与P4位置结合的疏水性空腔较大，可以容纳较大的疏水性氨基酸侧链。这些结构信息为设计选择性IAPs抑制剂奠定了基础。

图2 AVPI与XIAP-BIR2（A）和XIAP-BIR3（B）的结合模式[19]Figure 2 Binding modes of AVPI with XIAP-BIR2 (A)and XIAP-BIR3 (B)

2011年Cosford课题组发现将AVPI四肽中的Ile残基用芳基取代可以提高化合物对BIR2的结合能力，其中选择性最高的化合物3与XIAP的BIR2结 合 的Ki为 0.74 μmol·L-1，是该 化合物与 XIAP的 BIR3 结合能力的 7 倍（Ki= 5.5 μmol·L-1）[20]。Cosford课题组在这类化合物中用氮甲基丙氨酸替换了AVPI中的Ala，因为以前在BIR3选择性的化合物的研究中发现在Ala的氨基上引入甲基不会影响化合物的蛋白结合能力，但可以显著提高化合物的抑制肿瘤细胞生长的能力，可能是因为引入甲基后可以提高细胞穿透性。细胞活性研究表明，这类化合物在乳腺癌MDA-MB-231细胞系中可以增强TRAIL引起凋亡的能力。在上述研究的基础上，Cosford课题组对该类化合物的构效关系进行了进一步的探索，发现用Ala替换Pro可以进一步地提高选择性，其中选择性最优的化合物4与XIAP的BIR2的结合能力是其与XIAP的BIR3的结合能力的 70 倍（Ki：0.64 μmol·L-1vs40.15 μmol·L-1）；与化合物3类似，化合物4单一给药并未显示出抑制肿瘤细胞生长的能力，但同样能使细胞对TRAIL诱导的凋亡更加敏感[21]。

2014年罗氏公司公开了2项拟肽类的BIR2选择性IAPs抑制剂的专利，发现用芳环与AVPI衍生物中Pro的五元环并环后可以显著提高化合物与BIR2的结合能力和选择性，其中代表性的化合物5与XIAPBIR2 和 XIAP-BIR3 结合的 IC50分别为 0.013 μmol·L-1和大于 55 μmol·L-1，化合物 6 与 XIAP- BIR2 和XIAP-BIR3 结合的 IC50分别为 0.010 μmol·L-1和大于55 μmol·L-1[22-23]。这些结果进一步证明了以四肽为先导化合物研发BIR2选择性IAPs抑制剂的可行性。

3.3 经过高通量筛选并优化得到的新型BIR2选择性IAPs抑制剂

2013年Andrew课题组报道了一类新型的苯并西平类和苯并二氮杂䓬类BIR2选择性IAPs抑制剂[24-25]。该课题组首先通过高通量筛选发现了一个具有一定的BIR2选择性且相对分子质量与亲脂性均较低的化合物7，随后以化合物7为先导化合物进行了详细的结构优化，合成了一系列BIR2选择性小分子IAPs抑制剂，显著提高了化合物的蛋白结合能力和选择性，并改善了药代动力学性质，其中代表性的化合物8与XIAP-BIR2结合的IC50为 39 nmol·L-1，与 XIAP-BIR3 结合的 IC50为3.06 μmol·L-1。与其选择性结合并抑制 XIAP-BIR2的活性一致，化合物8在体内和体外均可以有效阻断XIAP与Caspase-3和Caspase-7的相互作用，而且不会引起c-IAP1/2的降解，表明化合物8并不能与c-IAP1/2的BIR3结构域有效结合。随后的研究发现，化合物8对细胞色素P4503A4酶（CYP3A4）具有很强的抑制作用（IC50= 1.8 μmol·L-1），因此不能用于进一步的临床研究。为了进一步改善成药性，该课题组在化合物8的基础上进行了进一步广泛且细致的优化，在保持与XIAP-BIR2的结合能力及选择性的同时，进一步改善了化合物的药代动力学性质，并显著降低了化合物对CYP3A4的抑制，其中最优的化合物9抑制XIAP-BIR2和XIAP-BIR3的Ki分别为45 nmol·L-1和 30.8 μmol·L-1。化合物 9 抑制 CYP3A4的 IC50是 16 μmol·L-1，与化合物 8 相比显著降低。药代动力学研究表明，化合物9具有良好的药代动力学性质和安全性，在体内实验中化合物9与DR5抗体conatumummab联合用药时可以有效增强Caspase-3和Caspase-7的活性。另外在机制研究中发现，化合物9在作用过程中没有激活非经典的NF-κB通路，表明该化合物不会有效抑制c-IAP1/2的活性。

4 结语与展望

细胞凋亡是癌症的主要特征之一，在细胞凋亡中有重要功能的蛋白很多都是抗肿瘤新药研发的重要靶点。IAPs是细胞凋亡中的逆向调节剂，已有多个靶向IAPs的BIR3结构域的小分子化合物和基于BIR3选择性IAPs抑制剂设计的二聚体IAPs抑制剂进入临床研究。不同于广受关注的BIR3选择性IAPs抑制剂，BIR2选择性IAPs抑制剂有其独特的功能。BIR2选择性IAPs抑制剂可以阻断XIAP与Caspase-3和Caspase-7的相互作用，并促进多种抗肿瘤药物的抗肿瘤效果，但不会引起c-IAP1和c-IAP2的降解，因此对BIR2选择性IAPs抑制剂的作用机制进行研究，可以进一步阐明XIAP、c-IAP1和c-IAP2的生物学功能，并促进以IAPs为靶点的新药研发。笔者所在课题组近年来一直在从事新型IAPs抑制剂的研发工作，近期工作集中于BIR2选择性IAPs抑制剂的设计、合成及生物活性研究，并探索BIR2选择性IAPs抑制剂的进一步利用。

在已报道的IAPs抑制剂中，最初研发二聚体IAPs抑制剂的目的是发展出能够模拟二聚的Smac蛋白的功能，同时与XIAP的BIR2和BIR3更有效结合的XIAP抑制剂，但已报道的二聚体IAPs抑制剂实际上都是基于BIR3选择性IAPs抑制剂设计的，利用BIR2选择性的化合物与BIR3选择性的化合物有可能设计出更有效的二聚体XIAP抑制剂。另外，已报道的二聚体IAPs抑制剂的抗肿瘤活性比BIR3选择性的单体IAPs抑制剂强100倍以上，而它们与XIAP的结合能力也比单体IAPs抑制剂强100倍以上；但有研究表明，IAPs抑制剂的抗肿瘤活性并不依赖于对XIAP的抑制，对其具体作用机制尚不清楚。因此，通过设计BIR2选择性IAPs抑制剂和BIR3选择性IAPs抑制剂组成的新型二聚体IAPs抑制剂，有可能进一步阐明二聚体IAPs抑制剂的作用机制，而且可以促进二聚体IAPs抑制剂在新药研发中的应用。

近年来，对蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）的研究已成为药物化学研究中的热点之一。PROTACs是由与靶蛋白结合的配体和与E3泛素连接酶结合的配体通过连接链连接而成的一类嵌合分子，可以同时与靶蛋白和E3泛素连接酶结合，促进靶蛋白的泛素化，使靶蛋白被蛋白酶体降解。XIAP、c-IAP1和c-IAP2均具有E3泛素连接酶的功能，因此IAPs抑制剂可被用于PROTACs的研发，但BIR3选择性IAPs抑制剂可以诱导c-IAP1和c-IAP2的快速降解，因此严重限制了它们在PROTACs研发中的利用。BIR2选择性IAPs抑制剂不会引起c-IAP1和c-IAP2的降解，因此有可能在基于IAPs的PROTACs的研发中得到应用。

最后，选择性地作用于cIAP1和cIAP2的小分子化合物已有报道，但选择性地作用于XIAP的小分子化合物一直未能发现。以前的研究结果表明，BIR2选择性IAPs抑制剂对XIAP-BIR2有较高的选择性，因此有可能利用对XIAP-BIR2有较高选择性的化合物设计选择性降解XIAP的PROTACs，从而实现对XIAP的选择性抑制。这类化合物在阐明不同的IAPs家族蛋白的生物学功能方面将会有广泛的应用。

综上所述，BIR2选择性IAPs抑制剂是一类新型的IAPs抑制剂，不仅可以用于以IAPs为靶点的新药研发，而且可以用于IAPs的生物学作用机制的研究中。