马斯奇 孙逸杰 朱旭强 李雪元 吴立新 闫东明

郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是发生最为广泛且最具恶性的一类中枢神经系统（CNS）肿瘤，在所有神经胶质肿瘤（gliomas）中，其占比为60%，每10万人中5人患病，预后差，即便实施积极的综合干预，基本每个GBM患者皆会复发，其后的中位生存期只有5～7个月［1-3］。因此，探讨GBM形成、发展，还有迁移、侵袭的相关机制备受医学领域重视。本研究制备siRNA-ATF3表达载体，并转染U373MG细胞株，以荧光定量PCR和Western blot检测筛选出有效的siRNA-ATF3表达载体，以免疫细胞化学法检测转染siRNA-ATF3表达载体的U373MG细胞株中ATF3、Maspin和MMP2的蛋白表达量，旨在分析在GBM组织形成、进行、迁移、浸侵与预后评估方面，MMP2、Maspin与ATF3所发挥的影响，为临床治疗GBM开辟新路径。

1 材料与方法

1.1实验材料采用上海细胞生物研究所和美国Invitrogen公司分别购得U373MG细胞株和纯化质粒pSilencer。胰蛋白酶、限制性内切酶（HindⅢ、BamHⅠ）、质粒超纯提取试剂盒、连接试剂盒、去内毒素质粒抽提试剂盒、小量提取质粒试剂盒、LipofectmineTM2000、RNA提取试剂Trizol和荧光定量PCR试剂盒均为Invitrogen公司（USA）产品，质粒超纯提取试剂盒、细胞裂解液和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自中国上海碧云天生物技术研究所，TaqDNA聚合酶购自日本Takara公司，实时荧光定量PCR（RTPCR）引物由中国上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2实验方法

1.2.1 U373MG细胞中ATF3 siRNA的构建、筛选与鉴定

1.2.1.1 表达载体pSilencer/siRNA-ATF3的构建：参考相关研究成果，同时借助设计软件，设计合成得到3对63 bp充分互补的序列，两端分布着BamHⅠ与HindⅢ黏性末端识别序列，待停止退火，生成的双链物质在不依赖酶切下能够实现载体pSilencer2.1 U6的直接连入。……