侯 力,孟 峻

(1内蒙古医科大学附属医院临床检验诊断学教研室,呼和浩特 010059;2内蒙古医科大学附属医院检验科;*通讯作者,E-mail:nmfrank@163.com)

细胞周期分为4个阶段,即G1、S、G2、M四期,此周期由细胞调控系统控制,细胞周期蛋白依赖激酶是细胞调控系统的核心成分。此外蛋白磷酸化和脱磷酸化之间的动态平衡对细胞周期调控也是至关重要的。这些与细胞周期蛋白的合成和降解一起,决定了细胞生长和分裂的顺序[1]。细胞分裂周期蛋白14A(Cdc14A)基因位于1p21染色体上,属于双特异性蛋白酪氨酸磷酸酶家族。它是一种重要的细胞周期调节磷酸酶,在真核生物G2期阻滞中发挥重要作用[2-4]。磷酸酶的Cdc14家族是高度保守的,并且Cdc14同源基因已经在一些生物体中被鉴定,不同物种中的Cdc14蛋白在定位和功能上有差异,在人类细胞中发现的Cdc14同源序列包括CDC14A和CDC14B(hCdc14A和hCdc14B)[5]。本实验通过构建Cdc14A基因的荧光表达载体,为研究Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换作用的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

目的基因通过本实验室合成。Stbl3感受态细胞和真核表达载体pcDNA3.1-MYC-C购自广州辉骏生物科技有限公司;HEK293细胞购自北京全式金生物技术有限公司。限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ购自ThermoScientific;DMEM培养基购自GIBOC公司;微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自上海生工B518131-0100;质粒小量抽提试剂盒购自上海生工B518191-0050;PrimeSTAR Max Premix(2X)购自Takara R045A;TaKaRa Taq购自Takara R001B;ClonExpress Mulit One StepCloning Kit连接酶购自诺唯赞C113-2;DNA测序由生工生物工程上海股份有限公司完成。洁净工作台(AIRTECH,SW-OJ-2F);CO2培养箱CB115(德国WTB-binder);恒温空气振荡器购自上海艾测电子科技有限公司;电泳仪(君意,JY600E)。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增目的基因 用于目的基因扩增的引物设计如下:Cdc14A-F:5′-GCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACC-3′,Cdc14A-R:5′-GTAATGAACGTATTCAGACTGAAGG-3′;mcherry-F:5′-CAGTCTGAATACGTTCATTACATGGTGAGCAAGGGC GAGGA-3′,mcherry-R:5′-GGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3′。

以实验室保存的真核表达质粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A中的目的基因作为模板,用PrimeSTAR高保真酶扩增。反应体系共20 μl:模板1 μl;前向引物1 μl;反向引物1 μl;Prime STAR Max(2X) 10 μl;加入无酶水补充体系至20 μl;95 ℃预变性5 min,95 ℃变性20 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,进行PCR共30个循环,72 ℃延伸3 min的条件下进行PCR扩增。存放于16 ℃。成功扩增目标片段后进行凝胶电泳,与DNA marker比对,目的是确定扩增是否成功。紫外灯下,用手术刀将含有目的基因片段的凝胶条带切取放至干净的1.5 ml EP管中,将溶液GB加入离心管中(按100 mg凝胶加100 μl GB溶液的比例)。当水浴温度为60 ℃时,将凝胶放置8-10 min,直到琼脂糖凝胶完全溶解,且在水浴过程中振荡3-5次。将其转移到DNA纯化柱中,后静置2 min,然后12 000 r/min离心1 min,弃滤液。加600 μl漂洗液PW(Buffer PW),以12 000 r/min离心1 min,弃滤液。重复加600 μl PW漂洗液,以12 000 r/min离心1 min,弃滤液。室温下,离心12 000 r/min 1 min。将柱子置于新的清洁1.5 ml EP管上,接着向柱中心加入35 μl 60 ℃已经提前预热的无酶水,离心12 000 r/min 1 min以洗脱出DNA。即得到PCR产物。

1.2.2 目的片段和载体双酶切 PCR产物15 μl用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切,pcDNA3.1-MYC-C载体5 μl用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切。目的片段Cdc14A-mcherry酶切体系共50 μl:10×Buffer 5 μl;目的片段15 μl;KpnⅠ 1.5 μl;XbaⅠ 1.5 μl;补充无酶水至总体积50 μl,37 ℃条件下进行酶切反应30 min。pcDNA3.1-MYC-C载体酶切体系共50 μl:10×Buffer 5 μl;pcDNA3.1-MYC-C空载体5 μl;KpnⅠ 1.5 μl;XbaⅠ 1.5 μl;补充无酶水至总体积50 μl,37 ℃条件下进行酶切反应30 min。双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳30 min,在紫外灯下,用手术刀将含目的片段和载体的凝胶条带切取,并放入无菌1.5 ml EP管中,将DNA目的片段根据DNA凝胶回收试剂盒的实验步骤回收,具体操作可参照试剂盒说明进行。

1.2.3 目段片段与载体连接 酶切回收的PCR产物和酶切回收的载体相连接,反应体系共20 μl:酶切回收的载体pCDNA3.1-MYC-C 100 ng;酶切回收的目的片段100 ng;5×CEⅡ Buffer 4 μl;ClonExpress Mulit One Step Cloning Kit连接酶2 μl;补充无酶水至总体积20 μl,37 ℃条件下连接30 min,然后冰浴5 min。

1.2.4 连接产物转化感受态细胞 取100 μl在冰浴中缓慢融化好的感受态细胞Stbl3于EP管中,加入连接产物10 μl,轻轻摇匀,冰浴30 min后于42 ℃水浴热休克60 s,立即冰浴2 min后加入300 μl LB培养基,混合摇匀,在37 ℃、225 r/min振荡培养1 h,将菌液在超干净的工作台中均匀地涂布在含有Amp抗生素(100 μg/ml)的LB板上,并在室温下放置直至液体吸收。然后将倒置的平板在37 ℃生化培养箱中培养过夜。

1.2.5 菌落PCR鉴定阳性转化子 配制菌检PCR体系共20 μl:挑取单个菌落;上游引物1 μl;下游引物1 μl;TaKaRa Taq Max 10 μl;加无酶水补充到总体积为20 μl。按这样的体系配制混合液,分别加到无菌的八连管内,于超净工作台内,选取单独的菌落8个,做好标记;用干净的小枪头,轻轻碰下平板内菌落的一边,把粘有菌的枪头,转移到有混合液的管子内,轻轻摇动枪头,使菌能分散到液体内,弃掉枪头。进行PCR扩增,反应条件:94 ℃、5 min,94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、1 min,共25个循环,72 ℃、3 min。16 ℃保存。扩增完成后,往PCR管中加入2 μl 10×loading Buffer,取10 μl样品点样到1%凝胶电泳,并加入5 μl Marker做参照。对照Marker大小,选取正确的菌落摇菌,测序。

1.2.6 用质粒小提试剂盒提取质粒 通过测序验证正确的阳性克隆,安排质粒小提。将5 ml培养过夜的菌液放入干净的离心管中,并在室温下以12 000 r/min离心2 min,尽可能多地倒出上清液。菌体沉淀中加入250 μl Buffer P1,将菌体沉淀利用涡旋振荡器完全悬浮;后加入250 μl Buffer P2,将离心管颠倒轻轻混合5-10次,并在室温下静置2-4 min,直到溶液变得清亮粘稠;后加入350 μl Buffer P3,立刻轻轻颠倒混匀5-10次,见白色沉淀物产生,在室温下静置2 min后,12 000 r/min离心10 min,将所有上清液移到Spin Columns中,放置2 min,以使质粒DNA完全结合到吸附柱的膜上。8 000 r/min离心0.5-1 min,弃去收集管中的液体。将500 μl WashSolution加到Spin Column中,10 000 r/min离心0.5-1 min,弃去收集管中的液体,重复将500 μl WashSolution加到Spin Column中,10 000 r/min离心0.5-1 min,再次弃去收集管内的液体,后以12 000 r/min离心2 min。将离心吸附柱Spin Columns置于无菌无酶的1.5 ml离心管中,将50-100 μl的Elution buffer加入到吸附膜的中央,并在室温下放置2 min。以10 000 r/min离心1 min,离心管底部即质粒DNA。

1.2.7 质粒酶切鉴定 质粒双酶切体系为20 μl:10×Buffer5 μl;pCDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry 2 μl;KpnⅠ 1 μl;XbaⅠ 1 μl;加无酶水补充体系至20 μl,37 ℃消化20 min。然后取6 μl 10 000 bp Marker和6 μl产物进行电泳检测。1.5%琼脂糖凝胶电泳后,选择酶切片段大小与预期相符合的阳性克隆保存并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,质粒DNA序列测定证实pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry荧光表达载体构建成功。

1.2.8 细胞培养和转染 在DMEM培养基(10%胎牛血清FBS,10 μg/ml链霉素,100 U/ml青霉素)中培养HEK293细胞。密度达到80%后,用fuGENG6转染试剂转染HEK293细胞。将HEK293细胞分散在100 mm培养皿中(2×106个细胞/皿,10 ml含有10%FBS培养液/皿)。将pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry转入HEK293细胞。24 h后,细胞共转染5 μg pCDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry。

1.2.9 Western blotting检测细胞内pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的表达 荧光表达载体转染HEK293细胞48 h后离心,收集目的细胞,提取总蛋白,检测蛋白浓度用BCA试剂盒。配制SDS-PAGE(5%上层浓缩胶和10%下层分离胶);将蛋白样品和适量上样缓冲液混匀上样到SDS-PAGE胶加样孔内,每孔上样约50 μg蛋白质,电泳条件100 V,90-120 min;300-400 mA,30-60 min湿转法将目的蛋白转至PVDF膜上;PVDF膜在洗涤液中漂洗3次,每次1-2 min;用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h,漂洗3次;一抗[兔来源的抗Cdc14A单克隆抗体(1 ∶200)]和β-actin抗体[兔来源的抗β-actin单克隆抗体(1 ∶1 000)]4 ℃孵育过夜,次日以TBST洗膜4遍(每遍8 min),然后辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔第二抗体(1 ∶5 000)室温孵育2 h,TBST漂洗3次;使用ECL试剂盒进行化学发光,凝胶成像检测分析。未转染的HEK293细胞组、用空载体pcDNA3.1-MYC-C转染的HEK293细胞组参照转染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的HEK293细胞组操作步骤,以anti-β-actin作为内参和anti-CDC14A抗体进行蛋白电泳检测。

2 结果

2.1 荧光表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的构建及鉴定

目的片段Cdc14A-mcherry与pcDNA3.1-MYC-C载体相连接,通过测序验证目的基因插入正确,测序结果见图1。通过限制性核酸内切酶KpnⅠ和XbaⅠ鉴定成功构建的荧光表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry(见图2)。电泳结果显示:目的基因条带、载体条带与预期片段大小相符,进一步证实了细胞内质粒的身份是pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry质粒。

2.2 荧光表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry在HEK293细胞中的表达

Western blotting法结果显示:转染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry荧光表达载体的HEK293细胞裂解液在相对分子质量为97 kD附近出现清晰的条带,未转染的HEK293细胞、用空载体转染的HEK293细胞则未检测出。Western blotting法检测结果表明:Cdc14A-mcherry融合蛋白在HEK293细胞中成功表达(见图3)。

MYC标签序列为GAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG;ATG之后的基因序列为Cdc14A-mcherry图1 重组质粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的测序结果Figure 1 Sequencing result of recombinant plasmid pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry

M.DNA marker DL10 kb;1.双酶切(KpnⅠ和XbaⅠ)pCDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry质粒DNA的产物图2 重组质粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry双酶切结果Figure 2 Results of double restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry

1.未转染的细胞;2.空载体转染的细胞;3.转染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的细胞图3 蛋白电泳检测目的基因表达结果Figure 3 Expression of target gene by protein electrophoresis

3 讨论

细胞周期进程由不同的蛋白发挥不同的功能进行调控,是一个有序的动态的过程,从而保证了生命的延续。Cdc14作为一种重要的双特异性蛋白激酶,和其他细胞周期调节因子组成一个高度相互联系的调控系统,在不同的生物体中发挥着重要作用。哺乳动物中Cdc14有两种亚型:Cdc14A和Cdc14B,它们具有各自特定的作用和功能,可以与磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基特异性结合,并参与了细胞内的大多数关键生命活动,包括细胞周期调控、减数分裂、有丝分裂等。此外,Cdc14与DNA复制、DNA损伤和DNA修复的关系也很密切[6,7],人类Cdc14A(hCdc14A)过表达会导致细胞周期一系列的功能紊乱,比如多极纺锤体,中心粒提早分离、畸形等,hCdc14A下调的表达会引起有丝分裂多种缺陷,包括姐妹染色体不分离,胞质不分裂等[8,9]。Schindler等[10]关于小鼠卵母细胞的研究表明:在生发泡(GV)期Cdc14A定位于细胞核,在生发泡破裂(GVBD)后Cdc14A聚集在凝集的染色体周围,在第一次减数分裂的前期(MⅠ)和第二次减数分裂的中期(MⅡ)则定位于整个细胞质,同时并没有观察到Cdc14A与微管组织中心的γ-微管蛋白的共定位,在MⅠ到MⅡ之间Cdc14A定位于纺锤体,调节小鼠卵母细胞成熟,促进卵母细胞MⅠ/MⅡ过渡。最近有研究[11-13]表明,哺乳动物体内的CDC14A磷酸酶活性对于听力和雄性生育是至关重要的。另外,Cdc14A可调节初级纤毛长度、调节细胞的迁移和黏附[14-16]。通过这些实验充分证实了研究Cdc14A是很有必要的。

关于小鼠Cdc14A荧光表达载体的构建在国内未见报道,在本实验中,首先合成带有荧光标记的目的片段Cdc14A-mcherry,然后对目的片段Cdc14A-mcherry和载体pcDNA3.1-MYC-C进行双酶切,最后将酶切后的目的片段和酶切后的载体相连接,经测序验证荧光表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry构建成功。利用细胞转染技术将测序验证正确的荧光表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry转染至HEK293细胞内,然后进行Western blotting,已知Cdc14A和mcherry蛋白的相对分子质量分别为67 kD及30 kD,而转染重组质粒pc-DNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的HEK293细胞组在相对分子质量为97 kD附近出现清晰的蛋白电泳条带,提示利用Cdc14A抗体检测的特异性条带为Cdc14A-mcherry融合蛋白。结果表明转染HEK293细胞内的目的片段成功表达。此实验为Cdc14A后续的相关研究奠定了良好基础。