何志凌,龙文杰,招煦杰

(1广州中医药大学第二临床医学院心血管科,广州 511000;2广州中医药大学第一附属医院老年病科;3广州中医药大学第二临床医学院重症医学科;*通讯作者,E-mail:vli321@163.com)

冠状动脉再通、及时恢复缺血心肌血液供应是缺血性心脏病最常见的治疗策略之一。血流的恢复可使梗死引起的损害最小化,从而降低死亡率。然而心肌再灌注损伤常引起氧化应激和炎症反应,可能会导致额外的心血管损伤,称为缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤[1]。目前I/R损伤的存在已成为影响心肌缺血治疗效果亟待解决的重大难题。檀香是我国名贵药材之一,据报道,檀香茶叶水提醇沉液在一定浓度时具有明显加强衰竭离体蛙心正性肌力和增加心率作用[2]。此外,藏药三味檀香散可能通过保护心肌线粒体结构、改善缺血心肌的能量代谢和降低心肌中一氧化氮合酶活性对大鼠心肌缺血损伤起保护作用[3]。miR-199a-3p是一种内源性短链非编码RNA,最近研究表明miR-199a-3p在I/R心肌细胞中表达下调,卡维地洛可能通过上调miR-199a-3p表达对I/R心肌细胞起到保护作用[4]。此外,有研究指出miR-199a-3p可能通过不同的调控机制影响缺血预处理保护心肌I/R损伤[5]。本研究构建心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型模拟I/R损伤过程,探讨檀香提取物对大鼠心肌细胞H/R损伤的影响,分析其机制是否与调控miR-199a-3p表达相关。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

大鼠心肌细胞H9c2购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司;檀香叶购于佛山绿缘生态科技有限公司;miR-199a-3p模拟物(miR-199a-3p mimics)及其阴性对照(miR-NC)、miR-199a-3p抑制物(anti-miR-199a-3p)及其阴性对照(anti-miR-NC)购于上海吉凯基因公司;细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)、膜联蛋白异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)双染法细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物科技公司;兔源活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)抗体、兔源磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体、兔源B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)抗体、山羊抗兔IgG二抗购于美国Abcam公司;细胞乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所;miRNA逆转录试剂盒、SYBR Green Fast qPCR Mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 H/R心肌细胞损伤模型的构建

复苏H9c2细胞后,将其接种到DMEM培养基(含10%胎牛血清)置于37 ℃、体积分数5%CO2的孵育箱中培养,选择对数期细胞进行实验。采用不含血清的DMEM培养基,并置于37 ℃、95% N2、5% CO2的孵育箱中培养10 h;接着更换成含10%胎牛血清的DMEM培养基,并置于条件为37 ℃、5% CO2、95%空气的孵育箱中常规培养2 h,制备H/R损伤模型[6]。

1.3 檀香提取物的制备

参照文献[7]方法制备檀香提取物。檀香叶阴干后,将檀香叶粉碎至0.3 mm,加入80%乙醇,在料液比为1 ∶10的条件下超声处理10 min,浸提48 h后过滤,洗涤2次,合并滤液,将滤液减压浓缩,并冷冻干燥,即得檀香叶粗提物,用无菌水稀释成浓度为50 mg/ml的溶液备用。

1.4 实验分组及处理

为探究檀香提取物对H9c2细胞H/R损伤的影响,将H9c2细胞分为对照(control)组、模型(H/R)组、H/R+0.1 mg/ml檀香组、H/R+0.2 mg/ml檀香组、H/R+0.4 mg/ml檀香组。H/R+0.1 mg/ml檀香组、H/R+0.2 mg/ml檀香组、H/R+0.4 mg/ml檀香组为H9c2细胞进行H/R处理后分别加入终浓度为0.1,0.2,0.4 mg/ml檀香提取物的DMEM培养基培养细胞24 h。采用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测cleaved Caspase-3蛋白表达,试剂盒检测LDH和CK活性,RT-qPCR试剂盒检测miR-199a-3p表达。

为检测miR-199a-3p对H9c2细胞H/R损伤的影响,将miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p分别转染H9c2细胞,H/R处理后,依次标记为H/R+miR-NC组、H/R+miR-199a-3p组、H/R+anti-miR-NC组、H/R+anti-miR-199a-3p组。采用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测cleaved Caspase-3蛋白表达,试剂盒检测LDH和CK活性。

为验证檀香提取物是通过调控miR-199a-3p表达进而影响H9c2细胞H/R损伤,将miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p分别转染H9c2细胞,H/R处理后,采用终浓度为0.4 mg/ml檀香提取物的DMEM培养基培养细胞24 h,依次记为H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-NC组、H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-199a-3p组、H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-NC组、H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-199a-3p组。采用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测cleaved Caspase-3蛋白表达,试剂盒检测LDH和CK活性。

1.5 CCK-8法检测细胞活力

将H9c2细胞按照1×104个/孔接种于96孔板,按照上述实验分组进行细胞处理,每孔加入10 μl的CCK8试剂,培养箱孵育4 h,酶标仪测定在450 nm处的各组细胞吸光度值(OD),计算细胞存活率。细胞存活率=处理组OD值/对照组OD值×100%。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

将H9c2细胞按照2×105个/孔接种于6孔板,按照上述实验分组进行细胞处理。收集各组细胞,用PBS重悬细胞并计数。取105个细胞,加入195 μl的Annexin Ⅴ-FITC结合液轻轻重悬细胞,加入5 μl的PI轻轻混匀,轻轻混匀,室温避光孵育20 min,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 Western blot检测cleaved Caspase-3蛋白的表达水平

采用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白,并测定蛋白浓度。取一定体积的蛋白样品和等体积的2×上样缓冲液混匀,沸水浴5 min变性后冷却至室温备用。制备浓缩胶和分离胶,按照每孔30 μg进行上样和聚丙烯酰胺凝胶电泳。当溴酚蓝到达胶的底端处附近时停止电泳。取出凝胶,漂洗后,利用湿法转膜装置进行转膜。洗膜后,按照5%脱脂奶粉封闭,洗膜,一抗(cleaved Caspase-3抗体1 ∶500稀释,Bcl-2抗体、GAPDH抗体1 ∶10 000稀释)孵育,洗膜,二抗(1 ∶2 000稀释)孵育,洗膜,化学发光显色步骤依次进行。凝胶分析系统采集图像,以cleaved Caspase-3蛋白灰度值和内参GAPDH蛋白灰度值比值表示cleaved Caspase-3的相对表达量。

1.8 试剂盒测定细胞培养液上清中LDH和CK活性测定

细胞按照实验分组进行处理后,收集各组H9c2细胞上清液,2 000 r/min离心20 min后取上清液,按照试剂盒说明书测定上清液中LDH、CK活性。

1.9 RT-qPCR试剂盒检测细胞miR-199a-3p的表达水平

细胞按照实验分组进行处理后,采用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA,测定浓度和纯度合格后,采用miRNA逆转录试剂盒合成cDNA,以cDNA为模板,利用SYBR Green Fast qPCR Mix进行qPCR扩增。miR-199a-3p上游引物:5′-CAATCGCTTTCAAATAG-3′,下游引物:5′-CAGGAGATGCTGTCATC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件为95 ℃预变性10 min;95 ℃变性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸35 s,35个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-199a-3p的相对表达量。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞活性及凋亡的影响

与对照组相比,H/R组H9c2细胞cleaved Caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著升高,Bcl-2蛋白表达、细胞存活率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组相比,H/R+0.1 mg/ml檀香组、H/R+0.2 mg/ml檀香组、H/R+0.4 mg/ml檀香组H9c2细胞cleaved Caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著降低,Bcl-2蛋白表达、细胞存活率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05,见表1,图1)。

图1 檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞的细胞凋亡及相关蛋白表达的影响Figure 1 Effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

表1 檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞的细胞活性及凋亡的影响

2.2 檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞受损程度及miR-199a-3p表达的影响

与对照组相比,H/R组H9c2细胞miR-199a-3p的相对水平显著降低,LDH和CK活性显著增加(P<0.05);与H/R组相比,H/R+0.1 mg/ml檀香组、H/R+0.2 mg/ml檀香组、H/R+0.4 mg/ml檀香组H9c2细胞miR-199a-3p的表达水平显著升高,LDH和CK活性显著降低(P<0.05,见表2)。

表2 檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞中LDH和CK含量的影响

2.3 过表达miR-199a-3p对缺氧/复氧心肌细胞活性、凋亡及受损程度的影响

与H/R+miR-NC组相比,H/R+miR-199a-3p组H9c2细胞miR-199a-3p的相对水平显著升高,cleaved Caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著降低,LDH和CK活性显著降低,Bcl-2蛋白表达、细胞存活率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05,见表3,图2)。

表3 过表达miR-199a-3p对缺氧/复氧心肌细胞活性、凋亡及受损程度的影响

2.4 抑制miR-199a-3p表达对缺氧/复氧心肌细胞活性、凋亡及受损程度的影响

与H/R+anti-miR-NC组相比,H/R+anti-miR-199a-3p组H9c2细胞miR-199a-3p的相对水平显著降低,cleaved Caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著升高,LDH和CK活性显著升高,Bcl-2蛋白表达、细胞存活率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,见表4和图3)。

表4 抑制miR-199a-3p对缺氧/复氧心肌细胞的细胞活性、凋亡及受损程度的影响

图3 抑制miR-199a-3p对缺氧/复氧心肌细胞的细胞凋亡及相关蛋白表达的影响Figure 3 Effect of inhibition of miR-199a-3p on apoptosis and expression of related proteins in hypoxia/reoxygenation cardiomyocytes

2.5 抑制miR-199a-3p能逆转檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞活性、凋亡及受损程度的影响

与H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-NC组相比,H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-199a-3p组H9c2细胞miR-199a-3p的相对水平显著降低,cleaved Caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著升高,LDH和CK活性显著升高,Bcl-2蛋白表达、细胞存活率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,见表5和图4)。

表5 miR-199a-3p抑制和檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞活性、凋亡及受损程度的影响

图4 抑制miR-199a-3p能逆转檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响Figure 4 Inhibition of miR-199a-3p reversed the effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

2.6 过表达miR-199a-3p能增强檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞活性、凋亡及受损程度的影响

与H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-NC组相比,H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-199a-3p组H9c2细胞miR-199a-3p的相对水平显著升高,cleaved Caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著降低,LDH和CK活性显著降低,Bcl-2蛋白表达、细胞存活率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05,见图5和表6)。

图5 过表达miR-199a-3p能增强檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响Figure 5 Overexpression of miR-199a-3p enhanced the effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

表6 过表达miR-199a-3p能增强檀香提取物对缺氧/复氧心肌细胞细胞活性、凋亡及受损程度的影响

3 讨论

檀香又名白檀香、浴香,是全球最重要的药用植物之一。研究显示,檀香提取物具有抗菌、抗氧化、抗癌等多方面药理作用[7-9]。最近研究发现丹参-檀香配伍提取物对小鼠心肌缺血损伤具有一定的保护作用[10]。本研究发现H/R处理后,H9c2细胞存活率、抗凋亡蛋白Bcl-2显著降低,细胞凋亡率和促凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表达显著增加,采用一定剂量的檀香提取物干预H/R处理的H9c2细胞后,心肌细胞的存活率、Bcl-2表现为明显增加,而细胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白的表达表现为明显降低,说明檀香提取物对H9c2细胞I/R损伤具有良好的保护作用。缺血性心脏病发生时,心肌组织中生成大量的活性氧,活性氧可直接损伤DNA,诱导细胞膜脂质过氧化和心肌细胞凋亡[11]。此外,大量的脂质过氧化产物丙二醛的释放引起细胞膜通透性改变,破坏细胞结构,导致LDH和CK等心肌酶的大量释放。因此,检测细胞培养液中LDH和CK活性是评价心肌细胞受损程度的重要指标[6,12]。本研究发现H/R处理后细胞培养液中LDH和CK活性表现为显著增加,而一定剂量的檀香提取物干预可降低H/R处理H9c2细胞培养液中LDH和CK活性。以上研究说明,檀香提取物可减轻心肌细胞损伤程度,提高心肌细胞存活率,抑制细胞凋亡,对心肌细胞H/R损伤具有保护作用。

miRNAs是机体生理和病理过程的重要调节因子,在心脏生物学和疾病中具有重要的发挥重要作用[13]。miR-199a-3p是miR-199/214簇成员之一,Chen等[14]研究表明,在心脏发生过程中miR-199a-3p表达上调,miR-199a-3p抑制剂可提高胚状体的跳动率,促进心脏特异性标志物的表达以及干细胞向心肌细胞分化。Lesizza等[15]认为单剂量心内注射促再生性miR-199a-3p可显著减少梗死面积,改善心肌梗死后的心脏功能。Chen等[16]研究发现,CRRL的缺失通过上调miR-199a-3p表达可促进新生大鼠内源性心肌细胞的体内外增殖,减轻心肌梗死后的重构,保护成年大鼠的心脏功能。本研究发现H/R处理后H9c2细胞中miR-199a-3p的表达显著降低,进一步研究发现过表达miR-199a-3p可提高H/R处理H9c2细胞的活力,抑制细胞凋亡,减轻细胞损伤程度,这与Torrini等[17]和Giacca等[18]miR-199a-3p具有诱导心肌细胞增殖活性的结论基本吻合,与檀香提取物对H/R心肌细胞损伤的保护作用一致。然而抑制miR-199a-3p表达后却加重H/R诱导的H9c2细胞损伤和凋亡。而且进一步研究显示抑制miR-199a-3p表达能逆转檀香提取物对H/R心肌细胞的保护作用,而过表达miR-199a-3p能增强檀香提取物对H/R心肌细胞的保护作用。以上研究说明檀香提取物通过上调miR-199a-3p表达对H/R心肌细胞发挥保护作用。然而,檀香提取物中包含黄酮类、酚类物、有机酸以及氨基酸、多肽、多糖等多种活性成分[7],探究其发挥H/R心肌细胞损伤保护作用的活性组分将是下一步研究重点。

综上所述,本研究发现檀香提取物能通过上调miR-199a-3p表达显著提高H/R损伤后细胞存活率,降低细胞凋亡率,减轻细胞损伤程度,对心肌细胞H/R损伤具有保护作用。