王小朋， 刘怡文， 原 翔， 邢瑶平， 王晓军， 周福有，，4△

1新乡医学院，新乡医学院第三附属医院胸外科，新乡 453003 2河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院，河南科技大学肿瘤医院，河南省肿瘤表观遗传重点实验室，洛阳 471003 3河南科技大学基础医学院，洛阳 471003 4安阳市肿瘤医院胸外科，安阳 455000

食管癌的发病率及死亡率极高，全世界每年新发的食管癌患者数量约50万例[1]，其中一半以上发生在我国。鳞状细胞癌是食管癌中最常见的组织学类型，约占食管癌总数的95%以上。

研究表明，多种病原微生物均可通过长期定植于机体，促进肿瘤的发生发展[2]。

具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，Fn)为口腔条件致病菌，其数量改变可引起微生态失衡。研究显示，食管癌前病变组织中Fn含量丰富，且Fn感染的食管鳞癌患者生存期显著缩短，虽具体致病机制尚不明确，但Fn与食管鳞癌的恶性进展密切相关[3]。著名的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin receptor，KIR)属于免疫球蛋白超家族的一员[4]，其中KIR2DL1是CD8+T细胞表面重要的抑制性分子，其介导的免疫抑制是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一，更是肿瘤免疫治疗的主要障碍[5]。CD8+T细胞表面KIR2DL1的表达在维持机体自身免疫耐受和调控免疫应答水平上发挥重要作用[6]，且与肿瘤的恶性进展呈正相关。临床资料显示，多种病原微生物均能诱导CD8+T细胞高表达抑制性受体[7]，使肿瘤细胞逃避免疫监视，因此推测Fn可能通过诱导CD8+T细胞高表达KIR2DL1，使肿瘤细胞发生免疫逃逸，促进食管鳞癌的恶性进展。

本研究采用RNAscope及免疫组织化学方法分别检测食管鳞癌患者癌组织及相应癌旁组织中Fn感染及CD8+T细胞表面KIR2DL1的表达情况，并分析Fn对CD8+T细胞表面KIR2DL1的诱导效应，及其与临床病理特征及5年生存率的相关性，为食管鳞癌治疗提供新思路和治疗手段。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2014年1月到2014年12月安阳肿瘤医院100例手术切除的癌组织及相应癌旁组织(距癌组织边缘≥5 cm的食管黏膜)石蜡包埋标本为观察对象。纳入标准：①术后病理诊断明确为食管鳞癌，且未合并其它肿瘤；②患者术前无呼吸系统等其他疾病，且未接受放化疗和免疫治疗；③治疗性食管鳞癌切除术后；④病例资料信息全面；⑤随访时间为60个月(5年)；⑥术后常规化疗；⑦以食管鳞癌导致的死亡为终点事件。排除标准：①术后病理诊断非食管鳞癌，或合并有其它肿瘤；②术前有呼吸系统等其他疾病，或接受过放化疗和免疫治疗；③病例资料信息不完整；④非食管鳞癌导致的死亡患者。本研究经安阳市肿瘤医院及医院伦理委员会审核批准，并于术前获得患者书面知情同意入组参与研究。

1.2 主要试剂与仪器

Fn特异性探针(16S rRNA特异探针)与RNAscope试剂盒(美国ACD公司)；光学显微镜(日本尼康公司，E100+ISH500)；SP-9000免疫组织化学试剂盒(中国中杉金桥生物技术有限公司)；CD8与KIR2DL1兔多克隆抗体(美国Abcam公司)；柠檬酸抗原修复液、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)、二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色剂(中国索莱宝生物技术有限公司)。

1.3 RNAscope检测癌组织及相应癌旁组织中Fn感染情况

取每例患者常规石蜡包埋的癌组织及相应癌旁组织标本块，以2 μm进行连续切片；60℃溶蜡，二甲苯脱蜡，制备靶标修复试剂，RNAscope双氧水处理，画疏水圈，RNAscope蛋白酶Plus处理，进行RNAscope显色检测(含Fn特异性探针杂交)，实验流程见参考文献[8]。

1.4 免疫组化法检测癌组织及相应癌旁组织中CD8+T细胞表面KIR2DL1表达情况

取同批患者常规石蜡包埋的癌组织及相应癌旁组织标本块，以2 μm进行连续切片；60℃溶蜡(1.5 h)后立即放入二甲苯脱蜡(3次×10 min)，依次梯度乙醇水化(100%、95%、90%、85%乙醇各5 min)后流水冲洗1 min；94～98℃下柠檬酸盐缓冲液抗原修复15 min，充分暴露抗原，PBS冲洗(3次×3 min)；过氧化物酶阻断剂封闭10 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗(3次×3 min)；滴加正常山羊血清避光封闭30 min，减少非特异性结合和背景染色；取2张连续切片，分别加入CD8和KIR2DL1特异性一抗(PBS稀释比1∶200)各50 μL，4℃一抗孵育过夜；次日复温1 h，PBS冲洗(3次×3 min)；滴加山羊抗鼠/兔聚合物室温下孵育30 min；PBS冲洗(3次×3 min)；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶室温下封闭；PBS冲洗(3次×3 min)；DAB显色，显微镜下观察显色适当，立即蒸馏水终止显色；苏木精复染；梯度乙醇脱水(85%、90%、95%、100%乙醇各1 min)；二甲苯透明(3次×3 min)；风干后中性树胶封片。

1.5 结果判读

RNAscope结果判定：Fn(16S rRNA)信号表达于肿瘤细胞中，呈红色颗粒状(图1)。在400倍视野下计数20个肿瘤细胞内颗粒数。100例标本中计数的颗粒数的平均值作为判定阳性细胞的阈值，大于该值为阳性细胞。计算每个标本中的阳性率，以阳性率的平均值作为判定阳性标本的阈值，大于此阀值的为阳性标本。在本次实验中，Fn在每个细胞中单独的红色颗粒≥8个或有成簇的信号为阳性细胞，每张切片中阳性细胞所占比例≥30%为阳性标本，评分细则参考文献[8]。

免疫组化结果判定：使用光学显微镜随机挑选5个400倍视野，观察2张连续切片中同一位置CD8与KIR2DL1表达情况。以2位资深病理科医生共同判定的阳性切片为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗的阴性切片为阴性对照。阳性表达判定标准：以2张连续切片同一位置淋巴细胞胞膜(CD8与KIR2DL1)同时出现浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为CD8+T细胞表面KIR2DL1表达阳性。取5个高倍镜(×400)视野评分的均值为最终免疫组织化学评分，0分定义为阴性，1～12分定义为阳性，评分细则见参考文献[9]。

分组：Fn诱导CD8+T细胞表面KIR2DL1阳性组为3张连续切片中Fn、CD8和KIR2DL1同时判定为阳性的组织样本，以Fn+CD8+KIR2DL1阳性组表示；不满足同时阳性的归为阴性组，以Fn+CD8+KIR2DL1阴性组表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，①计数资料一致性检验采用Cohen’s Kappa系数分析，相关性分析采用χ2检验；②生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法；③生存时间之间差异分析采用Log-rank检验；④以P<0.05为差异有统计学意义。100例食管鳞癌患者的术后随访时间为5年(60个月)，生存时间为入院时间至最后一次随访日期或死亡，删失数据为随访至60个月仍存活的患者，未删失数据为由食管鳞癌导致的死亡患者。

2 结果

2.1 食管鳞癌患者临床病理特征

本研究共纳入食管鳞癌患者100例，其临床病理特征如下：男66例，女34例；年龄<60岁44例，≥60岁56例；吸烟50例，不吸烟50例；饮酒52例，不饮酒48例；低分化21例，中高分化79例；侵及外膜71例，未侵及外膜29例；有淋巴结转移50例，无淋巴结转移50例；临床分期为Ⅰ/Ⅱ期57例，Ⅲ/Ⅳ期43例；轻度化疗敏感58例，中重度化疗敏感42例。

2.2 Fn感染与CD8+T细胞表面KIR2DL1表达的检测结果

食管鳞癌组织中可见癌细胞胞质出现红色颗粒，为Fn感染阳性(图1A)；连续切片中可见同一位置淋巴细胞胞膜同时出现棕黄色颗粒，为CD8+T细胞表面KIR2DL1表达阳性(图1B、1C)。且食管鳞癌组织中Fn感染与CD8+T细胞表面KIR2DL1表达具有显著一致性(P<0.05，表1)。食管鳞癌患者癌组织Fn感染阳性率显著高于相应癌旁组织(32%vs.4%,P<0.05)，食管鳞癌患者癌组织CD8+T细胞表面KIR2DL1表达阳性率显著高于相应癌旁组织(31%vs.3%,P<0.05)，见图1。

A、D、G：RNAscope检测Fn表达(16S rRNA)；B、E、H：免疫组化检测CD8表达；C、F、I：免疫组化检测KIR2DL1表达图1 食管鳞癌组织及相应癌旁组织中Fn感染与CD8+T细胞表面KIR2DL1表达检测结果(DAB显色，×400)Fig.1 Detection of Fn infection and KIR2DL1 expression on CD8+T cell surface in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent tissues(DAB staining，×400)

表1 Cohen’s Kappa系数分析食管鳞癌组织中Fn感染与CD8+T细胞表面KIR2DL1表达的一致性[例(%)]Table 1 Cohen’s Kappa coefficient analysis of the consistency between Fn infection and expression of CD8+T lymphocyte surface inhibitory receptor KIR2DL1 in esophageal squamous cell carcinoma[n(%)]

2.3 Fn诱导CD8+T细胞表面KIR2DL1高表达与食管鳞癌患者临床病理特征的相关性

结果见表2。Fn+CD8+KIR2DL1阳性与食管鳞癌患者性别、吸烟、饮酒、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期及化疗敏感性均相关(均P<0.05)，与患者年龄无关。

表2 Fn+CD8+KIR2DL1阳性组与食管鳞癌患者临床病理特征的相关性[例(%)]Table 2 Correlation between positive expression of CD8+T lymphocyte surface inhibitory receptor KIR2DL1 induced by Fn and clinicopathological features of patients with esophageal squamous cell carcinoma[n(%)]

续表2

2.4 Fn诱导CD8+T细胞表面KIR2DL1高表达与食管鳞癌患者5年生存预后的相关性

结果见表3、图2与图3。100例食管鳞癌患者术后5年总生存率及中位生存时间分别为34.80%、(37.00±4.50)个月，其中Fn+CD8+KIR2DL1阳性组5年生存率及中位生存时间为23.33%、(20.00±6.16)个月，显著低于阴性组38.57%、(42.00±5.23)个月，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表3 Fn+CD8+KIR2DL1阳性组与阴性组食管鳞癌患者生存时间(月)的均数和中位数Table 3 The mean and median survival time(months)of esophageal squamous cell carcinoma patients in Fn+CD8+KIR2DL1 positive and negative groups

图2 食管鳞癌患者术后5年Kaplan-Meier生存曲线Fig.2 Kaplan-Meier survival curve of patients with esophageal squamous cell carcinoma 5 years after operation

图3 Fn+CD8+KIR2DL1阳性组与阴性组食管鳞癌患者术后5年Kaplan-Meier生存曲线Fig.3 5-year Kaplan-Meier survival curve of esophageal squamous cell carcinoma patients in Fn+CD8+KIR2DL1 positive and negative groups

3 讨论

食管鳞癌预后极差[10]，虽然传统的手术、放化疗以及靶向治疗、免疫治疗等手段在肿瘤综合治疗中不断更新完善，但中晚期患者5年生存率仍低于20%[11]。食管鳞癌的病因至今尚不完全明确，其危险因素主要包括：吸烟、饮酒、饮食、慢性感染、免疫功能紊乱及遗传易感性等[12]。食管鳞癌早期诊断困难，因此，寻找精准的早期指标、有效的预防措施及靶向治疗方法显得尤为重要。长期以来，肿瘤研究中有关病原微生物的慢性感染探讨得不多，实际上，多种病原微生物均可通过重塑宿主免疫微环境，在肿瘤细胞中长期定植，导致肿瘤免疫逃逸，促进其恶性进展[13]。尽管病原微生物感染对肿瘤的作用机制尚不完全明确，但清除病原微生物有助于控制肿瘤的恶性进展[14]。而Fn作为毒力最强的口腔致病菌之一，其内毒素能抑制机体免疫应答，从而长期定植于机体，促进口腔鳞癌、食管鳞癌以及结肠癌等多种肿瘤的恶性进展[15]。

病原微生物对肿瘤免疫微环境的重塑机制至今尚未完全明确，但多数可通过诱导免疫细胞表面高表达抑制性受体，使机体抗肿瘤免疫失能，从而长期定植并协助肿瘤细胞免疫逃逸[16]。幽门螺杆菌感染阳性的胃癌患者胃黏膜中CD8+T细胞和NK细胞表面抑制性受体显著增高，使机体处于免疫抑制状态，促进癌细胞恶性增殖[17]；乙肝病毒感染阳性的肝癌患者与Fn感染阳性的结肠癌患者CD8+T细胞表面均高表达抑制性受体，从而协助癌细胞逃避免疫监视[18-19]。Fn为口腔条件致病菌，由于口腔颌面部静脉瓣膜缺如，Fn可随血液循环轻易播散至全身，参与多种疾病进程[15]，且与多种肿瘤发生发展密切相关[20]。前期关于Fn感染与肿瘤的相关研究大都集中在癌细胞自身，有关肿瘤微环境的作用则探讨不多。实际上，肿瘤的发生发展与肿瘤微环境密切相关[21]。肿瘤微环境不仅为肿瘤的恶性行为提供丰富的物质基础，且能调控免疫细胞，使其无法发挥正常功能，导致肿瘤免疫逃逸，促进其恶性进展[22]。

本研究发现食管鳞癌组织中Fn感染与CD8+T细胞表面KIR2DL1表达显著高于相应癌旁组织，且癌组织中二者表达具有显著一致性，提示癌组织的微环境更适于Fn定植，而Fn可能通过诱导CD8+T细胞表面KIR2DL1高表达，抑制免疫反应，使肿瘤细胞免疫逃逸。本研究分析了Fn诱导CD8+T细胞表面KIR2DL1高表达与食管鳞癌患者临床病理特征的相关性。结果显示在食管鳞癌中，Fn+CD8+KIR2DL1阳性组与患者性别、吸烟与饮酒显著相关，提示阳性组多为吸烟饮酒的男性患者，可能长期吸烟、饮酒导致口腔环境恶劣，Fn更容易感染并定植，从而诱导CD8+T细胞表面KIR2DL1高表达；且阳性组患者在低分化食管鳞癌的比例较中高分化组高，提示恶性程度更高的肿瘤及其微环境更利于Fn生存，并诱导CD8+T细胞表面高表达KIR2DL1；同时阳性组与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期及化疗敏感度显著相关，提示Fn对CD8+T细胞表面KIR2DL1的诱导效应可能促进了肿瘤的恶性进展；本研究还发现阳性组患者5年生存率及中位生存时间均明显低于阴性组，提示Fn对CD8+T细胞表面KIR2DL1的诱导效应可能会缩短食管鳞癌患者生存期。

综上所述，在食管鳞癌组织中Fn可能通过诱导CD8+T细胞表面KIR2DL1高表达，为自身持续感染提供有利微环境，从而促进肿瘤进展。有效清除Fn并抑制CD8+T细胞表面KIR2DL1表达可能会延长食管鳞癌患者的生存期，在食管鳞癌的临床治疗方面具有十分重要的意义和广泛的应用前景。