李田源 海龙 吴慧 洪锡田 卢晓旭 孙学明

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是颅内最常见的恶性肿瘤，占全部脑瘤的40%～50%，由于致残率、致死率高，严重危害着人类健康[1-2]。GBM 标准治疗方法是手术联合术后同步放化疗和后续替莫唑胺（temozolomide，TMZ）辅助化疗[3]。但是多数患者出现耐药后肿瘤复发，目前对于此类患者尚无标准的治疗方法[4]。研究发现，GBM 的生长和复发与肿瘤血管生成密切相关，指南可循的用于临床治疗复发GBM的靶向药物仅有贝伐单抗，但存在严重的高血压和出血等不良反应[5]。有研究报道[6-8]阿帕替尼联合TMZ治疗复发的GBM 有一定的临床疗效，但缺乏相关机制的研究。本研究通过阿帕替尼治疗耐药的GBM 对免疫微环境的影响进行探讨。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2018年7月至2020年10月郑州大学附属肿瘤医院标准方案治疗失败的GBM 患者51 例，其中男性30 例，女性21 例；年龄31～70 岁，中位年龄53 岁。所有患者经病理或MRI 证实为GBM 复发；依据MRI 检查确定可评价病灶；KPS 评分≥70 分，ECOG 评分≤2 分；血常规和肝肾功能正常（表1）。本研究经过本院伦理委员会批准并进行临床试验注册，入组患者均签署知情同意书，依从性好。

表1 51 例GBM 患者的一般资料

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 阿帕替尼500 mg/d，第1～14 天；休息7 天，开始口服标准TMZ 方案150 mg/（m2·d），连续口服5 天，28 天为1 个周期。连续服用直至疾病进展或不能耐受。

1.2.2 试剂和仪器 可溶性PD-1（soluble programmed death-1，sPD-1）、可溶性PD-L1（soluble programmed death-ligand 1，sPD-L1）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA 试剂盒（武汉华美公司），酶标仪IMAK（美国伯乐公司），迷你离心机、高速离心机（赛默飞世尔科技中国有限公司）。

1.2.3 免疫因子检测 服药前，早晨空腹采集外周血5～10 mL。服药后每4 周空腹采集外周血5～10 mL。30 min 至1 h 后，取上清液（血清和血浆），1 500 rpm/min离心10 min。包装于2 mL 无菌冻存管中，置于-80°冰箱中。ELISA 法检测血清IL-6、IL-10、血浆sPD-1、sPD-L1 的表达[9]。

1.2.4 肿瘤体积测量 1）图像获取：患者治疗前以及治疗后每个周期行同台3.0T MRI 平扫以及增强（包括以下序列：T1、T1 增强、T2、T2 FLAIR、DWI、PWI 和其他图像集），以DICOM 格式下载；2）体积分割、测量和建模：应用3D Slicer 4.10.2 哈佛医学院开发的用于医学图像分析（包括配准和交互式分割）和可视化（包括3D 渲染）的软件[10]，由两位经验丰富的放射科医生对图像进行分割，同时进行肿瘤建模，获取肿瘤体积（包括T1 加权对比度增强后的肿瘤体积）。

1.2.5 分子病理检测方法 免疫组织化学法检测IDH 突变；FISH 检测1p/19q 的缺失；焦磷酸测序检测患者的MGMT 甲基化水平；DNA sanger 测序检测TERT 基因启动子区域的突变情况。

1.2.6 评价标准 依据国际常见不良反应评价标准第3 版（CTCAE 3.0）评价不良反应，治疗期间每周评价。统计分析按照治疗期间不良反应的最大值评价。于治疗前、治疗后的每个周期依据MRI 结果评价近期疗效，依据神经胶质瘤评价标准（response assessment in neuro-oncology，RANO）进行疗效评价。

1.2.7 随访 治疗后每4 周分别进行MRI 疗效评价，连续16 周。以后每3 个月随访1 次，随访截至2020年10月，随访率100%。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析。对分组资料比较进行χ2检验，使用Kaplan-Meier 计算生存率，Log rank 检验进行组间比较；采用Cox 回归风险比例模型进行多因素分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效

截至末次随访时间，51 例患者均进行临床评价。完全缓解（complete response，CR）2 例，部分缓解（partial response，PR）15 例，疾病稳定（stable disease，SD）20 例，疾病进展（progressive disease，PD）14 例。其中ORR 为33.33%（17/51），疾病控制率（disease control rate，DCR）为72.5%（37/51）。中位无进展生存期（median progression-free survival，mPFS）为5.9 个月（95%CI：5.345～6.455），1年总生存期（overall survival，OS）为47.3%，2年OS 为24.9%（图1，2）。典型患者MRI 图像见图3。

图1 51 例GBM 患者的PFS

2.2 不良反应

全部患者均可耐受治疗，未出现5 级（死亡）不良反应。其中高血压14 例（25.4%），乏力10 例（18.2%），恶心呕吐9 例（16.4%），骨髓抑制6 例（10.9%），腹泻6 例（10.9%），手足综合征4 例（7.2%），转氨酶异常4例（7.2%），蛋白尿2 例（3.6%）。

2.3 免疫因子的变化

分析12 例患者有效血清标本的免疫因子变化，结果显示，sPD-L1 和IL-6 的变化与肿瘤体积变化呈正相关（r=0.874，P＜0.001；r=0.769，P=0.003）；sPD-1的变化与肿瘤体积变化呈负相关（r=-0.846，P=0.001）；IL-10 的变化与肿瘤体积的变化呈弱相关（r=0.538，P=0.071，图4）。

图2 51 例GBM 患者的OS

图 3 典型GBM 患者的MRI

图4 免疫因子的变化和肿瘤体积变化的相关性

3 讨论

GBM 恶性程度高，侵袭性强。虽然近年来手术、术后放疗和化疗的综合治疗取得较大进展，但GBM的复发率仍然较高，并且预后较差[11]。复发的GBM患者第二次进展的中位生存期为14 周。目前，对于复发和难治性的GBM 尚无标准的治疗方法[12]。

研究发现，GBM 的生长和复发与肿瘤血管生成密切相关，贝伐单抗作为一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体，已用于治疗复发性GBM，但存在严重的高血压和出血等不良反应[5]。阿帕替尼是一种新型口服小分子血管生成抑制剂，其高度选择性地抑制VEGFR-2 的活性，阻断血管内皮生长因子与其受体结合后的信号转导通路，从而强烈抑制肿瘤血管生成，发挥其抗血管生成作用[13]。Wang 等[14]报道阿帕替尼联合伊立替康治疗GBM 有一定的疗效，不良反应可控。尽管有报道阿帕替尼联合TMZ 治疗复发GBM 的临床研究，观察到有一定的疗效[6]，但鲜见研究阿帕替尼治疗耐药的TMZ 患者GBM 引起免疫因子的变化。

本研究结果显示，mPFS 为5.9 个月，与Wang 等[15]和Ge 等[16]报道的阿帕替尼联合TMZ 治疗复发的GBM 研究结果相近，分别为6.0 个月和4.9 个月。上述研究报道的不良反应主要为高血压和手足综合征，不良反应可控，与本研究的主要不良反应基本一致，说明阿帕替尼联合TMZ 安全有效，不良反应可控。

肿瘤微环境是由肿瘤间质、浸润的免疫细胞、肿瘤细胞及免疫因子等构成。已有足够的证据说明细胞因子参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移[17-19]。Landskron等[20]研究发现，在慢性炎症过程中，IL-6 等促炎细胞因子不仅可能导致肿瘤突变，还能刺激细胞增殖，降低凋亡。此外，这些细胞因子有利于肿瘤生长，在血管生成和转移中发挥重要作用，而IL-10 等抗炎细胞因子参与肿瘤免疫逃逸。多项研究表明[21-25]，血清细胞因子水平的测定，如IL-6 或IL-10，可能与肿瘤的发生或预后不良有关。部分研究发现IL-6 和IL-10 参与肿瘤生长和免疫应答[25-27]。Samaras 等[26]证实胶质瘤患者外周血单核细胞分泌的IL-6 和IL-10 均高于健康对照组。GBM 患者脑脊液和血清中的IL-6 可用于预测患者的预后[27-28]。本研究观察到IL-6 的变化与肿瘤体积变化呈正相关，IL-10 的表达水平与肿瘤体积变化呈弱相关性。Huang 等[29]研究发现，抗血管生成药物可以使异常的肿瘤血管正常化，并有可能使肿瘤免疫微环境向更具免疫支持性的方向转变，与本研究结果一致。

Cloughesy 等[30]报道PD-L1 在部分GBM 肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞中的表达水平较高。本研究发现，用药后肿瘤体积明显缩小的患者sPD-L1 表达降低，sPD-1 表达升高，与肿瘤体积的变化呈显著相关性。初步表明阿帕替尼治疗TMZ 耐药的GBM，不仅抑制肿瘤新生血管生成，而且可能激活GBM 免疫应答发挥抗肿瘤作用。

综上所述，阿帕替尼治疗TMZ 耐药的复发GBM疗效肯定，不良反应可耐受，可能激活GBM 免疫应答发挥抗肿瘤作用，有待进一步研究证实。