侯飞 吕娟 杨志贤 李浩宇 邓智勇

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）约占全部甲状腺癌的85%[1]，并有多灶性发生和区域淋巴结转移的特征。近30年来，甲状腺癌发病率持续增长，目前其发病率的增速已跃居恶性肿瘤第1 位[2]，致使甲状腺癌防治工作的形势十分严峻。因此，探寻影响甲状腺乳头状癌生长、转移相关的生物标志物具有重要的意义。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）在肿瘤微环境中扮演重要的角色，TAMs 可促进肿瘤侵袭、转移及肿瘤血管新生，在调节肿瘤发生、进展等方面发挥着重要作用。在不同的环境中，巨噬细胞可以分化为M1 和M2 两个亚型，存在于肿瘤微环境中的巨噬细胞，被称为TAMs，大部分表现为M2 型。有研究指出[3-4]，CD68 表达于M1 及M2 型TAMs，是泛巨噬细胞标志物，但不能区分M1 及M2型TAMs，而M2 型巨噬细胞的特异性标记物是CD206。有研究检测活检后口腔鳞状细胞癌组织中的TAMs，发现TAMs 在Ⅱ级鳞癌的浸润明显多于Ⅰ级鳞癌[5]，显然TAMs 在分化程度更低的口腔鳞癌浸润更多，提示TAMs 可能促进了肿瘤的进展。一项研究发现，M2 型巨噬细胞分泌Wnt 配体激活Wnt/βcatenin 信号通路，抑制结肠癌细胞分化，促进结肠癌的生长。但TAMs 与甲状腺乳头状癌的临床病理相关性尚缺乏充分的研究。因此本研究初步探索TAMs 是否与甲状腺乳头状癌的发生发展相关，选用CD68 与CD206 标记巨噬细胞，了解M2 型TAMs 在甲状腺癌中的浸润情况，并分析其与甲状腺癌碘难治等临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料

回顾性分析2010年1月至2017年12月云南省肿瘤医院 昆明医科大学第三附属医院就诊的甲状腺癌51 例、甲状腺良性病变17 例患者的临床资料，均行手术切除、病理确诊并有完整的组织标本。入选标准：1）本院手术切除，组织标本保存完整；2）术前未接受化疗、放疗和靶向治疗等；3）病理学证实，临床资料完整；4）术后行规范131I 治疗及TSH 抑制治疗。排除标准：1）有其他恶性肿瘤或既往肿瘤病史；2）合并其他可能引起体内激素变化的疾病及因素；3）患者本身存在可能导致CD68 与CD206 表达异常的因素。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂、抗体及免疫组织化学法检测 试验抗体CD206（91 992）购自美国CST 公司；CD6（76 437）购自美国CST 公司，Elivision Super HRP（mouse/rabbit）IHCKit 试剂盒、DAB 显色试剂盒均购自福州迈新试剂公司。按照试剂盒说明书进行操作。用已知的阳性组织切片作为阳性对照，用PBS 代表一抗作为阴性对照。根据入组患者病理号，于本院病理科选取对应的标本，所有标本先用10%福尔马林固定，石蜡包埋，以4 μm 厚度进行切片，置入60℃烘箱内烤片。在柠檬酸缓冲液中进行抗原修复之前，梯度酒精中水化。切片与抗CD68、CD206（1∶150 稀释度）一抗在4℃下孵育过夜。PBS 洗涤3 次后，将辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗在37℃孵育1 h。采用免疫组织化学法染色。

1.2.2 免疫组织化学法结果判定 被染色的组织5个高倍视野（×200）下进行统计肿瘤细胞总数和阳性细胞数,得到阳性细胞百分比。阳性细胞率0～25%为0 分，26%～50%为1 分，51%～75%为2 分，75%为3 分。按照多数阳性细胞表现出的染色强度进行记分：无显色时为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。将上述两项得分相加：0 分为阴性（-），1～2 分为弱阳性（+），3～4 分为中等强度阳性（++），5～6 分为强阳性（+++）。以CD68 阳性判定为通用型TAMs，记为CD68+TAMs；CD206 阳性判定为M2型TAMs,记为CD206+TAMs；CD68 与CD206 均表达阳性，记为CD68+/CD206+TAMs。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。样本率的比较使用χ2检验，有序定性资料使用秩和检验，相关性分析采用Spearman 等级相关分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本情况

所有病例中，男性26 例，女性42 例，年龄15～71 岁，平均年龄45（45±16）岁。甲状腺癌51 例，其中PTC 42 例、鳞状细胞癌9 例。甲状腺良性病变17 例，其中结节性甲状腺肿9 例、滤泡性腺瘤8 例。

2.2 免疫组织化学染色结果

在甲状腺良性病变及甲状腺癌组织中，CD68 与CD206 均定位于巨噬细胞细胞膜和（或）胞质中，表现为黄褐色或者是棕褐色颗粒状（图1）。免疫组织化学法结果显示，42 例PTC 组织中主要有CD68+/CD206+细胞和CD68-/CD206+两种阳性细胞，在甲状腺癌组织内未发现CD68+/CD206-细胞存在。本研究42 例PTC 组织中，存在CD68+TAMs 分布的患者为14 例，存在CD206+TAMs 分布为37 例；存在CD68+/CD206+TAMs 分布为14 例，存在CD68-/CD206-TAMs 分布为5 例，存在CD68-/CD206+TAMs 分布为23 例。

图 1 采用免疫组织化学法检测甲状腺癌和甲状腺良性病变组织中CD68+TAMs 与CD206+TAMs 的表达

2.3 CD68+、CD206+和CD68+/CD206+TAMs 在甲状腺癌与甲状腺良性病变组织中的比较

CD68+TAMs、 CD206+TAMs 和 CD68+/CD206+TAMs 在甲状腺癌组织中的分布强度均高于甲状腺良性病变，差异具有统计学意义（Z=-2.121，P=0.034；Z=-2.026，P=0.043；χ2=-2.080，P=0.038），见表1。

表1 CD68+TAMs、CD206+TAMs 在甲状腺良恶性病变中分布的比较

2.4 CD68+、CD206+及CD68+/CD206+TAMs 在PTC组织中的分布与临床病理特征之间的关系

CD68+TAMs 的分布强度在有淋巴结转移组及肿瘤大小≥2 cm 组中，分别高于无淋巴结转移组和肿瘤大小＜2 cm 组，差异具有统计学意义（Z=-2.462，P=0.014；Z=-2.19，P=0.029），见图2。同样，CD68+/CD206+TAMs 在上述两组中的分布差异具有统计学意义（χ2=5.979，P=0.014；χ2=4.725，P=0.030），见图3。CD68+TAMs 和CD68+/CD206+TAMs 的分布在PTC患者性别、年龄、甲状腺外是否受侵、是否远处转移、单灶或多灶、是否碘难治及AJCC Ⅰ+Ⅱ期/Ⅲ+Ⅳ期中差异均无统计学意义（均P＞0.05）。CD206+TAMs的分布在所有临床病理特征中差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

图2 PTC 中CD68+TAMs 分布与肿瘤大小及颈部淋巴结转移的关系

图3 PTC 中CD68+/CD206+TAMs 的分布与肿瘤大小及颈部淋巴结转移的关系

2.5 CD68+、CD206+及CD68+/CD206+TAMs 的分布与PTC 肿瘤大小及分期的关系

在42 例PTC 组织中，肿瘤大小＜2 cm 组和Ⅰ+Ⅱ期组，CD206+TAMs 阳性例数多于CD68+TAMs，差异具有统计学意义（Z=-4.275，P＜0.001；Z=-4.421，P＜0.001）；而在肿瘤大小≥2 cm 组和Ⅲ+Ⅳ期 组，CD68+TAMs 与CD206+TAMs 分布差异无统计学意义（Z=-1.465，P=0.178；Z=-1.053，P=0.353），见表2，3。

表2 PTC 中CD68+TAMs、CD206+TAMs 的分布与肿瘤大小的关系

2.6 CD68+TAMs 与CD206+TAMs 相关性分析

Spearman 相关性分析表明，PTC 患者组织中CD68+TAMs 与CD206+TAMs 分布水平呈正相关（r=0.322，P=0.038）。

2.7 CD68+、CD206+及CD68+/CD206+TAMs 的分布与PTC 患者甲状腺相关激素水平之间的关系

CD68+TAMs 的分布强度分别在42 例PTC 患者术前的T3、TgAb、FT3 及FT4 正常组与异常组之间差异具有统计学意义（Z=-3.242，P＜0.001；Z=-1.986，P=0.047；Z=-3.080，P=0.002；Z=-2.682，P=0.007）。

CD68+/CD206+TAMs 的分布强度分别在患者术前的T3、FT3 及FT4 正常组与异常组之间比较差异具有统计学意义（χ2=8.842，P=0.009；χ2=10.371，P=0.005；χ2=11.351，P=0.002）。CD206+TAMs 分布情况在患者术前血清甲状腺激素：T3、T4、TSH、TG、TgAb、TMAB、FT3、FT4、rT3 正常组与异常组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 PTC 中CD68+TAMs、CD206+TAMs 的分布与肿瘤分期的关系

3 讨论

肿瘤的发生、发展不仅与肿瘤本身的生物学特性有关，且与肿瘤所在的微环境紧密相连。在不同的微环境里，巨噬细胞可以分化为M1、M2 两个亚型，即通过经典激活途径来源的M1 表型和替代激活途径来源的M2 表型。M1 型TAMs 显示肿瘤抑制功能，能够杀死微生物或肿瘤细胞，M2 型TAMs 有促进肿瘤血管生成、淋巴管生成、基质重塑和转移的作用[6]。肿瘤相关巨噬细胞大部分表现为M2 型，表达与M2 型相似的分子标记和细胞因子，如CD163、CD206 等[7-8]。研究发现，TAM 与多种肿瘤的不良预后有关，如乳腺癌、膀胱癌和食管癌等[9-11]。然而国内外关于TAMs在甲状腺癌中的研究较少。

实际上，CD68 被认为经典的巨噬细胞标志物，代表两种具有相反生物学特性的巨噬细胞，即M1 和M2 型TAMs[12]，仅以CD68+TAMs 来研究其与甲状腺的相关性并不可靠。因此，本研究以CD68 标记M1型TAMs 与M2 型TAMs，以CD206+TAMs 指标来表示M2 型TAMs。结果发现，在PTC 患者中，CD206+TAMs患者比CD68+TAMs 患者多，此与国内外文献所报道的TAMs 和M2 型TAMs 的从属关系不一致[12-13]。有报道，树突状细胞同样表达CD206[14]，可以猜测PTC微环境中可能有其他细胞表达CD206。本研究发现CD68+TAMs、CD206+TAMs 和CD68+/CD206+TAMs 在甲状腺癌中的分布强度均高于甲状腺良性病变组织，提示甲状腺肿瘤微环境里存在肿瘤有关的炎症，TAMs 可能促进了甲状腺癌的发生、发展。上述情况发生可能是由于肿瘤细胞或者间质分泌了趋化因子，如CCL2、CCL5 和CCL7 等吸引外周循环中存在的巨噬细胞，或肿瘤微环境里的单核细胞被诱导分化为肿瘤相关巨噬细胞来促进肿瘤的进展[15]。本研究采用Spearman 等级相关性分析表明，PTC 患者中CD68+TAMs 与CD206+TAMs 分布水平呈正相关，说明PTC 微环境中TAMs 在偏向M2 型TAMs 极化的趋势可能。

本研究得出在42 例PTC 组织中，CD68+TAMs的分布强度在有淋巴结转移组及肿瘤大小≥2 cm 组中均高于无淋巴结转移组和肿瘤大小＜2 cm 组，同样，CD68+/CD206+TAMs 在上述两组中的分布强度也具有明显不同，证明了TAMs 可能与PTC 颈部淋巴结转移及肿瘤大小有关。另外，本研究结果发现，CD206+TAMs 在肿瘤大小＜2 cm 和肿瘤分期Ⅰ期或Ⅱ期的情况下分布强度高于CD68+TAMs，然而在肿瘤大小≥2 cm 组中两者的分布强度差异无统计学意义。有报道提示[16]，在肿瘤生长早期阶段，TAMs 极化主要是以M1 型TAMs 占主导，M2 型TAMs 数量较少，此时的TAMs 主要是抗肿瘤，当肿瘤发生、发展至一定阶段，肿瘤微环境里各种细胞因子影响下，TAMs 主要是以M2 型为主导，转变为促肿瘤作用。这与上述研究结果相矛盾，本研究推测在PTC 生长早期，其微环境中M1 型TAMs 可能主导极化的时间不长，主要以M2 型TAMs 极化为主。此外，本研究还发现CD68+TAMs 的分布与患者术前甲状腺相关激素T3、TgAb、FT3 及FT4 水平相关；CD206+/CD206+TAMs的分布与患者的T3、FT3 及FT4 水平相关。本研究推测，TAMs 还可能参与甲状腺激素的调节，或体内甲状腺激素变化水平对M2 型TAMs 分布有影响，其两者之间是如何相互作用的需要进一步探索。

本研究的局限性为回顾性研究，需要更大的样本量，多中心的研究来得出更具有代表性的结果。本研究仅纳入甲状腺乳头状癌及鳞状细胞癌，未纳入滤泡状癌、髓样癌及未分化癌，良性病变的病例也较少，后续需要继续补充病例，完善研究。粗略的探索TAMs在甲状腺癌组织中的分布情况，后续需要进一步研究其对甲状腺癌的作用的分子机制。

综上所述，M2 型TAMs 在肿瘤微环境中可能参与了甲状腺癌的发生、发展；暂未发现TAMs 在甲状腺癌碘难治组与碘易治组之间确切的差异性分布。TAMs 与PTC 的颈部淋巴结转移、肿瘤大小及血清甲状腺相关激素水平可能有关，其之间是如何相互作用的需要更为深入的研究。另外，本研究给临床诊治带来一种思路，可以通过研究一种靶向M2 型TAMs向M1 型TAMs 转变，或直接消灭M2 型TAMs 的药物，为甲状腺癌的治疗提供一种新的策略。