王晓敏，王楠楠，苏凯，武桂祥，马士崟，李慧

下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma, HSCC)是上消化道粘膜引起的恶性肿瘤,占头部和颈部所有鳞状细胞癌的5%[1]。下咽组织解剖结构特殊,暴露困难,该部位恶性肿瘤发病隐匿，早期症状不典型，且生物学特性恶劣,易发生淋巴结转移，故大多患者就诊时往往已是晚期(Ⅲ期和IV期)，常常伴有局部或远处转移，故而预后不良[2]。近年来，下咽癌的治疗模式已由手术为主的综合治疗转变为同步放化疗(如肿瘤未控再行挽救性手术)，虽然喉功能的保存率较以前提高，但其生存率并无明显改变，5年期存活率仅为25%～40%[3]。因此，在分子水平上开展HSCC发生、发展机制的研究将有助于提高HSCC的诊治水平。长链非编码RNA (long non-coding RNA，LncRNA)肺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1， MALAT-1) 属于核内保留RNA，主要通过与细胞核内多种蛋白质相互作用，在转录水平和转录后水平参与基因的表达调控[4]。其在多种正常组织中表达，而在多种肿瘤中表达明显上升，并能促进肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭等[5]。研究[6]表明过表达MALAT-1通过激活ERK / MAPK、p53、Wnt / β-catenin等信号通路和细胞周期等途径增加细胞增殖。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)，属于MAPK家族，ERK主要被各种生长因子、离子射线、过氧化氢等磷酸化而激活,激活的ERK信号能够下调部分抗增殖或肿瘤抑制基因[7]。已有文献报道MALAT-1在口腔鳞状细胞癌患者高表达[8]以及在喉癌、下咽癌发展中的作用[9]，本课题组先前对MALAT-1在喉鳞状细胞Hep-2细胞的增殖和迁移已有部分基础研究[10]，但是在下咽癌中尚未有进一步研究。前期预实验结果显示下咽癌组织中MALAT-1高表达，我们推测在下咽癌中MALAT-1可能是促癌基因，并可能通过激活ERK / MAPK发挥重要作用。本研究旨在分析LncRNA MALAT-1及ERK蛋白在下咽癌患者中的表达及其两者与临床病理特征的关系，为HSCC的发病机制及预后因素提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 一般资料 选取2015年3月—2020年4月通过耳鼻咽喉科头颈外科就诊并接受手术治疗的未经放化疗药物治疗的HSCC患者35例，选取手术切除的肿瘤标本及同一患者癌旁下咽粘膜组织(距离肿瘤外缘>2 cm)，所有标本经病理科 2 位专业技术人员诊断后确诊癌组织为HSCC，癌旁为下咽黏膜正常组织。将下咽鳞状细胞癌组织设为观察组，将癌旁组织设为对照组。随访时间从手术时间开始，截止2021年2月或死亡或失访(电话随访)。研究过程符合我院医学伦理委员会的相关规定。

1.2 实验试剂与仪器 miRNeasy®Mini kit，miScriptRT kit和miScriptSYBRGreen PCR Kit由德国Qiagen 公司提供，引物序列由Qiangen公司设计合成，EliVisionTMplus试剂盒购于迈新生物技术有限公司，DAB显色试剂盒及其他试剂购于上海碧云天公司，ERK蛋白抗体购自美国CST公司。主要仪器有美国GE公司的NanoVueTM Plus 光度仪,美国ABI公司的Step One TM Real-Time PCR 仪。

1.3 下咽鳞状细胞癌组织中总RNA的提取 依据miRNeasy®Mini Kit使用说明书提取细胞总miRNA,NanoVueTM Plus 光度仪检测RNA浓度和纯度,A260/A280 比值需在1.9～2.1。利用miScriptRT Kit逆转录RNA, 选择GAPDH作为内参, 引物序列如下:MALAT1:F: 5'-AGC GGA ACG AAT GTA ACT-3', R: 5'-TTG CCT ACC ACT CTA AGA TTG T-3'；GAPDH:F: 5'-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3'，R: 5'-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3'。依据miScript SYBR Green PCR Kit 说明书在ABI Step One TM Real-Time PCR 仪进行Q-PCR, 每组设3个复孔, 计算复孔的Ct平均值, 按照2-ΔΔCt相对定量计算公式得到相对定量结果。

1.4 免疫组织化学法(IHC)检测ERK蛋白表达水平 下咽鳞状细胞癌组织及对应的癌旁组织的石蜡标本按以下步骤处理：经过4%中性甲醛溶液固定，切片4 μm，经二甲苯溶液脱蜡和梯度浓度的乙醇溶液脱二甲苯至水洗；3 %H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；5～10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的ERK一抗或一抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃过夜；PBS冲洗，5 min×3次；滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释)，37 ℃孵育10～30 min；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37 ℃或室温孵育10～30 min；PBS冲洗，5 min×3次；滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37 ℃孵育10～30 min；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃或室温孵育10～30 min；PBS冲洗，5 min×3次；显色剂显色(DAB或AEC)，自来水充分冲洗，复染，封片。阳性对照采用已知的阳性切片，空白对照采用同种属的IgG代替。

1.5 结果判定 免疫组织化学染色结果参照参考文献[7]的评分方法:0级，无染色；1级浅黄色，2级棕黄色，3级棕褐色。阳性细胞百分率分级：0级，阳性细胞<5%；1级，5%～25%;2级，25%～50%；3级≥50%。组织学评分=染色强度×阳性细胞百分率。0～3分为阴性，4～6分为阳性，7～9分为强阳性。

2 结果

2.1 LncRNA MALAT1 在观察组和对照组中的表达 与对照组癌旁组织比较，下咽癌组织中LncRNA MALAT1的表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 观察组和对照组中LncRNA MALAT1的表达水平比较

2.2 观察组和对照组中ERK的表达 ERK蛋白阳性表达为棕褐色，主要显色在细胞质中(图1)，其在癌组织中的阳性率为88.57%，高于癌旁组织的22.86%,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

1A 正常喉癌旁组织中ERK阴性表达 1B 喉癌组织中ERK阳性表达，伴有淋巴结转移图1 ERK蛋白在癌旁组织和癌组织中的免疫组化染色

表2 观察组和对照组中ERK的表达水平比较

2.3 下咽癌组织中LncRNA MALAT1高表达与临床病理参数特征的关系 下咽鳞状细胞癌组织中LncRNA MALAT1的表达水平与患者的性别、年龄、吸烟史和肿瘤直径均无关(P>0.05),而与患者的淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05)。见表3。

表3 LncRNA MALAT1表达水平与临床病理参数的关系

2.4 下咽癌组织中ERK蛋白阳性表达水平与临床病理参数特征的关系 下咽鳞状细胞癌组织中ERK蛋白的表达水平与患者年龄、吸烟史和肿瘤直径等指标无关(P>0.05),而与患者的性别、淋巴结转移和TNM分期等指标有关(P<0.05)。见表4。

表4 ERK表达水平与临床病理参数的关系

2.5 下咽癌组织中LncRNA MALAT1高表达和ERK蛋白的表达与患者预后的关系 下咽癌患者术后1～60个月，LncRNA MALAT1高表达及低表达的5年总生存率分别为22.9%(8/27)和75.00%(6/8)(见图2)。ERK阳性和阴性患者的5年总生存率分别为 38.71%(12/31)和75.00%(3/4)(见图3)，差异均具有显著性意义(P<0.05)。

图2 下咽癌患者组织LncRNA MALAT1表达生存曲线

图3 下咽癌患者组织ERK表达生存曲线

3 讨论

下咽鳞状细胞癌占所有头颈部癌症的3%～5%，60%～85%的下咽癌患者在诊断时临床分期达到III-IV期。因此尽管采用积极的多学科治疗，下咽癌的预后都比较差。此外临床阳性淋巴结出现率高，复发率高以及第二原发性肿瘤也可能导致预后不良[11]。因此，在分子水平上开展HSCC发生、发展机制的研究将有助于提高HSCC的诊治水平。非编码RNA(ncRNA)是一类新兴的转录物，由基因组编码，但大部分不翻译成蛋白质。尽管没有翻译，ncRNAs在多种细胞和生理功能中扮演着重要角色。特别是长链非编码RNA(长度大于200 nt的ncRNA)在调节染色质动力学、基因表达、生长、分化和发育中起着关键作用[12]。研究[13]证实LncRNAs参与HSCC的进展，然而关于LncRNA MALAT1在下咽癌中的作用尚不明确。近年来人们陆续发现LncRNA MALAT1在多种肿瘤疾病中的生物学功能作用，有研究[14]表明，在胃癌、肝癌、食管癌等多种肿瘤中LncRNA MALAT1的过表达促进了肿瘤细胞的增殖和转移，此外，还有研究[15]证实LncRNA MALAT1过表达可以促进NSCLC中的上皮细胞转化为间充质细胞从而促进脑转移瘤的形成。已有的研究[16]结果表明LncRNA MALAT1在喉癌、鼻咽癌、口腔癌和食管鳞状细胞癌中上调，因此我们认为LncRNA MALAT1与下咽癌的进展有关。本研究通过RT-qPCR检测观察组和对照组中LncRNA MALAT1的表达水平，发现LncRNA MALAT1在下咽癌组织中高表达，并显著高于癌旁组织，提示LncRNA MALAT1参与下咽癌的发生发展。通过分析临床病理特征发现，LncRNA MALAT1与下咽癌组织的淋巴结转移、TNM分期等指标有关。进一步分析5年生存率发现，LncRNA MALAT1高表达的患者总生存率33.33%明显低于低表达患者的75%，本资料结果提示LncRNA MALAT1高表达可能具有促进癌症进程的作用并影响下咽癌患者的预后效果。

ERK属于有丝分裂原蛋白活化激酶(mitogen-activated protein kinase , MAPK)三大家族之一，主要由生长因子，例如表皮生长因子，(epidermal growth factor, EGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)激活, 调节有丝分裂信号，因此能够通过磷酸化含有丝氨酸或者苏氨酸磷酸化位点基序的特异性底物蛋白来控制细胞增殖、生存、分化和迁移。已有研究[17]表明在胶质瘤中LncRNA MALAT1通过促进 P-ERK1/2 的表达水平，最终激活 ERK/MAPK 信号通路，发挥促进增胶质瘤细胞增殖、侵袭的功能。为了证实ERK在下咽癌中的作用，在本研究中，采用IHC检测ERK的阳性表达，与对照组相比ERK在观察组中表达水平明显上调，ERK在观察组中的阳性表达水平为88.57%显著高于对照组22.86%。通过分析临床病理特征发现，ERK与淋巴结分期和TNM分期有关。此外，ERK阳性和阴性患者的5年总生存率分别为 38.71%和75.00%，表明ERK的高表达促进肿瘤组织的增殖、分化，从而发生淋巴结转移以及临床预后较差。ERK表达量增高表明其可能通过是ERK/MAPK信号通路从而促进肿瘤的进程，与文献报道的结果一致[17]。需要指出的是，我们的分析结果表明，ERK与患者性别也有关，造成这种结果的原因可能是本研究样本中女性患者少，仅有1例，且ERK阳性占比高。由于本研究收集样本的量较少，在下一步研究中，将扩大研究的样本量，同时对下咽癌患者进行定期随访，以进一步分析LncRNA MALATl的表达值在下咽癌患者预后判断中的意义。

综上所述，本研究结果表明LncRNA MALAT1和ERK蛋白均在下咽癌患者中表达显著上调，并且其表达水平与TNM分期及淋巴结转移指标有关，笔者认为LncRNA MALATl对下咽癌早期诊断及疗效监测的潜在生物标记物提供了理论基础，同时对其作用与下咽癌的可能性机制进行了初步分析，未来需要明确LncRNA MALATl在下咽癌中与ERK作用的具体机制，为下咽癌治疗提供依据。