陈宁 ，陈晨，王小雨 ，陆瑞科，高红琴，李少华，郝梨岚，叶志强，赵倩，张韵红*

女性生殖道中栖息着庞大的菌群，对女性生殖道健康起着极重要的作用，国内外研究提示，菌群失衡与不孕、早产、宫颈癌等妇科疾病有密切关系。目前基于女性生殖道微生态系统研究多局限于16S rRNA基因高通量测序方法研究，使用16S rRNA基因扩增子测序的研究在分类学上存在对微生物种水平的分辨率较低和缺乏物种特异性功能推断能力的局限性[1]。宏基因组鸟枪法测序通过对微生物的全组DNA进行测序分析，可以充分发现宏基因组序列和功能差异信息，不但能了解微生物群体的多样性和丰度，还能发掘和研究具有特定功能的新基因[2]。本研究采用宏基因组鸟枪法测序，旨在探索女性生殖道微生物组和生殖道健康相关疾病的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

招募苏州高新区2018年6～7月参与“两癌”筛查项目的女性，年龄35～65周岁，现场充分知情告知并签订知情同意书者入组，然后进行个人信息和样本采集，个人信息进行匿名处理。涉及临床诊断相关资料来自“两癌”筛查项目。资料和样本齐全纳入分析。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集和处理 医生在为入组志愿者进行妇科检查时，用无菌棉拭子在宫颈外口旋转10～20圈，蘸取足量分泌物，置于专用微生物保存液常温保存。两周之内寄往实验室-80℃冰箱保存待DNA提取。

1.2.2 微生物基因组总DNA提取及测序 采用美基生物通用型DNA抽提试剂盒(MagPure Universal DNA KF Kit)对样本的DNA进行提取，将提取好的DNA产物用赛默飞QubitTM双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒(Qubit dsDNA HS assay kit)进行定量。选取提取质量合格的DNA样本进行测序文库构建，使用Covaris E220非接触式超声波破碎仪进行核酸打断，Axyge公司AxyPrep核酸分离试剂盒核酸纯化，赛默飞ABI PCR仪进行接头连接等实验操作。测序文库应用DNBSEQTM测序技术在国产测序平台DIPSEQ(华大生命科学院，深圳)进行宏基因组鸟枪法测序(双端测序，100bp)。

1.2.3 物种注释及菌群类型 对测序数据进行去除低质量序列、去除人源序列以及利用MetaPhlAn2软件进行物种注释。注释结果选取种水平进行分析，定义在一个样本中相对丰度≥50%的物种为该样本的优势种，并以此为该样本的菌群类型，没有物种的相对丰度≥50%的类型定义为混合类型(Diverse类型)。

1.3 统计学处理

采用R统计软件对检测数据进行统计学处理，计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人群分布特点

本研究通过苏州高新区“两癌”筛查项目，招募了年龄在35～65岁之间的373例女性，平均(46±7.6)岁，年龄分布如图1A所示。其中绝经期女性有96例，占整个人群的25.74% (图1B)。该人群孕产史如图1C,D所示，几乎所有女性都有过孕产经历(≥99%)。对于育龄期女性，统计其半年内使用的避孕方式，依次为：避孕套(63.10%)，宫内节育器(29.52%)，结扎(1.48%)，还有5.90%的人群没有进行避孕(图1E)，图1见彩插2。

2.2 下生殖道菌群分布特点

373例女性的微生物在种水平的分布情况如图2所示(见彩插2)，惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌和加德纳菌是在人群中占比最高的三种菌，以它们为主导菌(相对丰度在样本中≥50%)的，分别占人群的20%，15%和13%。其中惰性乳杆菌和卷曲乳杆菌属于益生菌，它们为女性的阴道环境提供酸性环境，抑制有害菌的生长。而加德纳菌是细菌性阴道病发病密切相关的重要种属之一。人群中有38%的女性为Diverse类型，即在她们阴道内没有明显的主导菌，是由多种微生物共存的状态。此外，在人群中还检测出了有疱疹病毒(human herpesvirus)和HPV病毒(human papillomavirus)感染的个体。

2.3 育龄期妇女和绝经期妇女的阴道菌群比较

对育龄期妇女和绝经期女性的菌群类型进行对比，发现有明显差异。惰性乳杆菌型、卷曲乳杆菌型在绝经期女性中锐减，仅占11.46%和5.21%，远低于育龄女性，而Diverse型绝经期明显高于育龄期，差异有统计学意义(P<0.05)，加德纳菌型占比与育龄期妇女占比比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见下页表1。

表1 育龄期与绝经期妇女阴道菌群类型差异比较 [例(%)]

2.4 育龄期女性不同避孕方式对阴道菌群影响

本项目研究人群中，育龄期女性主要采用避孕套和宫内节育器的避孕方式(图1E)。研究发现采用不同避孕方式的女性阴道菌群有明显的差异，使用宫内节育器避孕的女性Diverse型比例高于采用避孕套避孕的女性，加德纳菌型的占比低于采用避孕套避孕的女性，差异有统计学意义(P<0.05)，详见下页表2。

表2 避孕套和宫内节育器对育龄女性阴道菌群类型差异比较[例(%)]

3 讨论

阴道环境是复杂的各种因素相互作用的结果。微生物与上皮细胞之间的相互作用形成黏膜免疫，微生物的组成对于维持健康的阴道环境起着独特的作用[3]。乳杆菌被认为是最重要的阴道微生物，乳杆菌产生的乳酸维持阴道较低的pH值，抑制有害菌的繁殖。而目前公认为的“不健康”的菌群环境，是以少乳杆菌、多厌氧菌共存的环境，微生物的物种多样性较高[4]。“不健康”的菌群环境会导致生殖道感染及增加一些妇科疾病的发生概率，如细菌性阴道病、性传播疾病、早产等[5-7]。目前对下生殖道的研究大多采用16S rRNA基因测序，同时主要集中于对育龄期女性的菌群分析。Ravel等[8]对396例来自5个种族的育龄女性的阴道菌群进行16S rRNA基因测序，发现阴道菌群主要分为5种类型，四种以乳杆菌为主，分别是卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌，以及第5种是以低乳杆菌，高比例的厌氧菌为主，包括加德纳菌、阴道阿托波氏菌、二路普雷沃尔菌等多种菌并存(Diverse型)。其中Diverse型被认为是“不健康”的菌群环境，更容易导致阴道炎症的发生。他们的研究结果同时也显示，不同的种族，在阴道菌群上也呈现差异。对于96例亚洲女性来说，惰性乳杆菌型比例最高，占人群的42.7%。卷曲乳杆菌型和Diverse型分别占25%和19.8%。Chen等[9]对110例育龄期女性上下生殖道多个部位进行采样，并分析不同部位之间菌群的差异，结果显示，同一个体阴道1/3处、阴道后穹隆以及宫颈管的菌群相似度非常高，而宫颈管作为一个连接上下生殖道的关键部位，其菌群具有更大的预测子宫类疾病的潜能，如对子宫内膜异位症导致的不孕、子宫腺肌病等患病可能性的预测。因此，本研究主要以宫颈菌群为代表来研究下生殖道菌群。

相比于目前国内外在下生殖道菌群的研究情况，本研究选取的研究对象具有更大的年龄跨度(35～65岁)，包含育龄期女性和绝经期女性。此外，国内外对于生殖道菌群的研究多采用16S rRNA基因的高通量测序，而16S rRNA基因扩增测序法在技术上具有很多的局限性，其一，依赖于PCR扩增存在一定的偏向性；其二，读长只覆盖该基因的部分高变区，短序列很难从种或亚种水平进行区分；其三，检测的对象均为细菌，无法达到细菌、真菌、古生菌、病毒等所有微生物全覆盖。由于生殖道样本具有极高的宿主率(约99%)，使获得足够有效宏基因组数据量的研究成本大幅度提高，大规模宏基因组研究难以开展。目前已公开发表的数据中女性下生殖道的宏基因组数据总和不足千例，而对中国女性的下生殖道宏基因组数据仅有一篇2018年Li等[10]发表在自然通讯(Nature Communications)上。本研究采用宏基因组鸟枪法测序技术，从细菌、真菌、病毒等多维度系统描绘苏州地区的女性下生殖道菌群结构，目前国内外使用此法研究基本空白，因此采用此技术是本研究项目的一个创新点和突破点。

本研究结果发现苏州高新区女性生殖道菌群主要为4种类型，惰性乳杆菌型、卷曲乳杆菌型、加德纳菌型和Diverse类型，分别占人群的20%、15%、13%和38%。与Ravel只针对育龄期女性下生殖道菌群结果相比，本人群中乳杆菌型比例大大降低，这与其中包含约1/4比例的绝经期女性有关。此外，本研究在检测中还发现在以前研究中罕有报道的一些非细菌的信息，如病毒(pepper vein yellows virus)，疱疹病毒(human herpesvirus)，HPV病毒(alpha papillomavirus)等，这些非细菌信息的检测丰富了女性生殖道微生态图谱。本研究人群中，有39例女性在两癌筛查中HPV呈现阳性，而基于宏基因组鸟枪法测序结果对HPV病毒也能直接检出，这提示后续可通过该方法将HPV与其他微生物相组合，寻找某种能提高宫颈癌发生发展预测准确性的标志物组合，从而提高宫颈癌的筛查效率。

此外，本研究中还收集了孕产史、绝经情况、避孕方式等表型信息，研究结果发现阴道微生物与年龄、避孕方式的选择有密切的关联。绝经期女性生殖道菌群中的乳杆菌型即惰性乳杆菌型和卷曲乳杆菌型比育龄期女性中的占比明显减少，而多为Diverse型。说明绝经期女性乳杆菌含量降低，阴道的酸性环境减弱，开始出现多种菌并存的现象，不同于育龄期女性的菌群结构比较健康，多以乳杆菌为主。这也与目前相关研究显示未绝经期的女性比绝经期的女性的微生物更单一，乳酸菌含量比绝经期女性更高的结果一致，未绝经期妇女的雌激素水平较高，较高的雌激素和糖原水平会促进阴道分层鳞状上皮和保护性黏液层的厚度增加，而充足的糖原为乳杆菌提供营养，从而维持乳酸菌在较高水平，乳杆菌分泌乳酸，维持阴道较低的pH，从而抑制各种有害菌的生长。绝经后，雌激素水平下降，糖原和阴道上皮减少，乳酸杆菌含量开始减少，pH相对增高，导致各种杂菌在种类和含量都有所增加[11]，从微生物菌群角度描绘绝经期女性生殖道健康状态，并降低其他

感染疾病的风险或为临床关注和研究提供新的理论和证据。另外本研究结果显示，不同的避孕方式(如男用避孕套和宫内节育器)也会引起生殖道微生物的变化。相对于使用宫内节育器女性，使用避孕套的女性卷曲乳杆菌型占比增多，同时多种杂菌减少，即Diverse型降低，这与之前的研究保持一致[12]，这种避孕方式对于女性的阴道菌群健康更加有利，能更好地维持阴道菌群健康。本研究从下生殖道菌群的角度出发，为女性在避孕方式的选择上提供指导。

越来越多证据表明，生殖道微生物群在妇女健康和生殖功能的重要性。本研究通过宏基因组鸟枪法对中国苏州高新区女性的下生殖道菌群进行了分析，构建了比较完整的阴道微生物图谱。同时发现一些影响菌群变化的因素，如绝经、避孕方式，为后续女性生殖道与妇科疾病的关联分析提供了重要的参考依据。