王 杰,徐嘉伟,杨宝辉,李浩鹏

(西安交通大学第二附属医院骨二科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:lhp-3993@163.com)

近年来,随着医疗水平及材料科技水平的提高,对于骨科种植体的量的需求及质的需求也日益提高。现阶段临床中,在骨科种植体应用最为广泛的材料当属Ti-6Al-4V钛合金。Ti-6Al-4V钛合金由于其良好的生物相容性和力学性能而被广泛应用于负重骨的大空隙填充物和关节假体的制造[1,2]。但是,在临床实际应用过程中,钛合金种植体材料仍存在些许不足之处,如偶尔可出现与骨组织融合迟缓,甚至是融合失败的现象,从而导致骨科种植体手术失败等。从种植体设计的角度来看,强调种植体的几何形状、表面修饰、生物功能化和促血管系统的形成对提高功能性骨再生和延长种植体寿命具有重要意义[3-6]。因此,本研究团队设计利用喷砂表面改性技术对钛合金材料表面进行改性处理,从而希望能够进一步提高钛合金材料的生物相容性,进而减少和避免钛合金种植体与骨组织融合迟缓甚至是融合失败的发生。应用新技术对钛合金种植体材料表面进行处理并期望其能够应用于临床,这势必需要对经表面处理的钛合金材料进行生物毒性的检测,以及探究其对细胞黏附、增殖及分化的影响。因此,本实验旨在研究以喷砂表面改性技术制备出的钛合金种植体对成骨细胞黏附、增殖以及分化的影响,以此为骨科种植体材料的发展及临床实际应用提供坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Ti-6Al-4V钛合金片(φ10 mm×1 mm)(西北有色金属研究院,中国,西安)、钛砂(西北有色金属研究院,中国,西安)、砂纸(上海芸博检测技术有限公司,中国,上海)、胰酶(武汉普诺赛生命科技有限公司,中国,武汉)、戊巴比妥钠(北京迈瑞达科技有限公司,中国,北京)、双抗溶液(上海素尔生物科技有限公司,中国,上海)、Ⅱ型胶原酶(上海泽叶生物科技有限公司,中国,上海)、MTT溶液(北京索莱宝科技有限公司,中国,北京)、DMSO(北京索莱宝科技有限公司,中国,北京)、0.5%结晶紫溶液(北京索莱宝科技有限公司,中国,北京)、甲醇(南京森贝伽生物科技有限公司,中国,南京)、10%醋酸(南京森贝伽生物科技有限公司,中国,南京)、TritonX-100裂解液(上海远慕生物科技有限公司,中国,上海)、ALP活性检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司,中国,北京)。

1.2 仪器设备

多用喷砂机(铭辉喷砂机械有限公司,中国,东莞);超净工作台(苏净安泰公司,中国,南通);Primo vert倒置相差显微镜(Carl Zeiss AG公司,德国,耶拿);MCP-17AIC二氧化碳恒温培养箱(SANYO公司,日本,大阪);SC-3610低速离心机(武汉华科达实验设备有限公司,中国,武汉)。

1.3 样品制备

将Ti-6Al-4V钛合金片表面经500目、1 000目、1 500目和2 000目砂纸逐步打磨抛光,然后置于蒸馏水中超声荡洗20 min,再放入多用喷砂机中进行表面喷砂改性处理,制备出喷砂表面钛合金样品,以此作为实验组,记为喷砂处理组。将Ti-6Al-4V钛合金片表面经500目、1 000目、1 500目和2 000目砂纸逐步打磨抛光,然后置于蒸馏水中超声荡洗20 min,后进行干燥处理,以此作为对照组,记为Ti-6Al-4V对照组。

1.4 扫描电镜观察钛合金样品表面

利用导电胶将两组钛合金样品分别固定在样品台上,进行喷金处理后在扫描电镜下进行钛合金样品表面形态观察。

1.5 兔成骨细胞原代培养

取2月龄日本大耳白兔(1.5-2 kg)，由西安交通大学医学中心实验动物中心提供。耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠致死，备皮并消毒兔髂骨区域，仔细操作分离兔髂骨，去除肌肉软组织及表面骨膜结缔组织，置于双抗溶液中浸泡5 min，后将髂骨移至无菌操作台中，将髂骨剪碎成2 mm×2 mm×2 mm的小块，然后再次置于双抗溶液中浸泡5 min，后过滤除去双抗溶液并以PBS冲洗3次。之后转移至装有5 ml胰酶的15 ml离心管，37 ℃水浴消化30 min，并且每10 min震荡1次。弃上清，在离心管中加入0.1% Ⅱ型胶原酶10 ml，37 ℃消化40 min，期间每10 min震荡1次，留取上清液，以1 000 r/min，10 min条件进行离心处理，重悬后接种至培养瓶中，加入成骨细胞培养基并放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。2-3 d换液1次。

1.6 扫描电镜观察共培养细胞形态

成骨细胞按5×104/ml的密度分别接种于两组钛合金样品表面,之后便放置于37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养3,7 d。之后用PBS清洗2-3遍,进行固定、脱水处理后喷金观察。

1.7 MTT比色法实验检测细胞毒性

成骨细胞按5×104/ml的密度分别接种于两组钛合金样品表面,待上述两组钛合金共培养兔成骨细胞培养至1,4,7 d后,用0.25%胰蛋白酶将其消化,并用移液枪进行吹打处理,重悬制得细胞悬液并接种至96孔板中。并将单独经成骨细胞培养液培养的成骨细胞也按照上述时间点培养作为MTT比色法实验的空白对照。之后每孔加入20 μl MTT(5 g/L),继续放入恒温箱中培养4 h后弃去培养基,每孔加150 μl DMSO。室温下震荡15 min,调节酶标仪设置波长为490 nm,检测吸光度(OD)值。实验重复3次,最终实验数据取3次实验数据的平均值。细胞相对增殖率=(实验组OD值均值/空白对照组OD值均值)×100%。根据细胞相对增殖率将细胞毒性分为5级:80%-100%为0级;60%-80%为1级;40%-60%为2级;20%-40%为3级;0-20%为4级。根据5级细胞毒性标准分级,对检测结果进行分级。

1.8 结晶紫染色实验检测细胞黏附

成骨细胞按5×104/ml的密度接种于两组钛合金样品表面,培养12,24 h后,去除培养基并用PBS清洗,用冰甲醇固定20 min,PBS清洗20 min,之后加入0.5%结晶紫溶液(含20%甲醇)染色30 min,此后去离子水清洗3次,10%醋酸洗脱,调节酶标仪设置波长为490 nm,检测吸光度(OD)值。OD值与细胞黏附呈正相关关系,因此可以借助检测细胞的OD值间接评估样品表面的细胞黏附情况。

1.9 细胞成骨分化的ALP活性检测

成骨细胞按5×104/ml的密度接种于两组钛合金样品表面,成骨细胞培养基培养1,4,7 d,TritonX-100裂解液裂解处理1 h,取上清液离心,按照ALP活性检测试剂盒说明书进行检测。

1.10 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,数据以均值±标准差形式表示,采用单因素方差分析及LSD检验,两组间计量资料的差异比较采用两独立样本t检验分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 材料样品展示

Ti-6Al-4V对照组样品,肉眼观察可见样品表面光滑,无划痕(见图1A);喷砂处理组样品,肉眼观察可见样品表面较粗糙(见图1B)。

A.Ti-6Al-4V对照组 B.喷砂处理组图1 钛合金种植体实验片Figure 1 Specimens of titanium alloy implants

2.2 扫描电镜观察结果

Ti-6Al-4V对照组样品表面呈现出光滑表面,散在分布有细小不规则隆起(见图2A);喷砂处理组样品表面呈现出“叠瓦”样的不规则隆起,其表面相较Ti-6Al-4V对照组样品表面而言较为粗糙(见图2B)。

图2 钛合金种植体表面形貌的扫描电镜观察Figure 2 Surfaces of titanium alloy implants under scanning electron microscopy

2.3 原代培养兔成骨细胞形态学观察

待兔成骨细胞培育至48 h后,观察发现兔成骨细胞贴壁生长,折光性强。镜下细胞形态主要呈现出梭形和多边形,细胞轮廓清晰,生长良好,排列较为紧密规则(见图3)。

图3 兔成骨细胞形态学观察 (×100)Figure 3 Morphology of rabbit osteoblasts (×100)

2.4 扫描电镜观察共培养细胞形态

观察在两组钛合金样品表面接种3 d的成骨细胞,细胞体部下存在有阴影,Ti-6Al-4V对照组样品表面的成骨细胞贴附成长,有少量的丝状伪足生出;喷砂处理组样品表面的成骨细胞贴附生长,有较多的丝状伪足生出并且伪足相互之间有连接(见图4)。在两组钛合金样品表面接种7 d的成骨细胞数量有了一定的增长,Ti-6Al-4V对照组样品表面的成骨细胞的丝状伪足生出数目有所增加,并且相互之间连接成网状;喷砂处理组样品表面的成骨细胞的丝状伪足大量生长,并且连接成近乎片状分布,有向着生长为细胞集落的趋势发展(见图4)。

2.5 MTT实验结果

在第1,4,7天,三组间成骨细胞种植后的OD值差异均有统计学意义(P<0.05,见表1)。喷砂处理组钛合金种植体实验片在第1,4,7天的细胞相对增殖率分别为(91.98±1.21)%、(95.09±1.62)%以及(97.07±1.72)%;而Ti-6Al-4V对照组钛合金种植体实验片在第1,4,7天的细胞相对增殖率分别为(88.17±1.13)%、(91.03±1.33)%及(93.56±1.67)%,两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。喷砂处理组和Ti-6Al-4V对照组钛合金种植体实验片在第1,4,7天的细胞毒性标准分级均为0级。并且经两独立样本t检验分析,喷砂处理组钛合金种植体实验片的兔成骨细胞增殖率高于Ti-6Al-4V对照组,两组之间比较差异有统计学意义(P<0.05,见图5)。

表1 三组成骨细胞种植后的OD数值对比表Table 1 Comparison of OD values of osteocytes after

与Ti-6Al-4V对照组相比,*P<0.05图5 MTT比色法检测细胞相对增殖率柱形图Figure 5 Relative cell proliferation rate by MTT colorimetry

2.6 结晶紫染色实验检测细胞黏附效果

由于细胞的OD值与细胞黏附呈正相关关系,因此可以借助检测细胞的OD值间接评估样品表面的细胞黏附情况。成骨细胞接种于两组钛合金材料表面培养12 h和24 h,喷砂处理组表面的细胞OD值高于Ti-6Al-4V对照组(P<0.05,见图6),因此,可以认为喷砂处理组表面的细胞黏附效果优于Ti-6Al-4V对照组,喷砂处理可以增强成骨细胞黏附效果。

与Ti-6Al-4V对照组相比,*P<0.05图6 结晶紫染色实验检测细胞黏附效果Figure 6 The cell adhesion detected by crystal violet staining assay

2.7 细胞成骨分化的ALP活性检测

喷砂处理组在第1,4,7天的ALP活性均高于Ti-6Al-4V对照组(P<0.05,见图7),并且,喷砂处理组相较Ti-6Al-4V对照组在第4天和第7天均显示出更为明显的ALP活性优势。这提示喷砂处理组的成骨分化活性高于Ti-6Al-4V对照组。

与Ti-6Al-4V对照组相比,*P<0.05图7 喷砂处理组和Ti-6Al-4V对照组ALP活性比较Figure 7 Comparison of ALP activity between sandblasting treatment group and Ti-6Al-4V control group

3 讨论

喷砂表面改性处理技术可以在材料表面形成一层薄的喷砂材质涂层,以改变被处理材料的表面形貌特征。本研究将喷砂表面改性处理技术应用至钛合金种植体制备过程中,在钛合金种植体表面形成一层喷砂涂层,以改变钛合金种植体的表面形貌特征。本研究对两组钛合金种植体材料样品表面进行电镜扫描检测发现,与Ti-6Al-4V对照组相比,喷砂处理组钛合金种植体样品表面形貌明显更为粗糙。细胞在材料表面的黏附、生长与材料的表面理化性质有关,尤其是与材料表面的形貌特征相关,粗糙的表面往往有利于细胞的黏附及生长[7-10]。本研究通过电镜扫描观察两组共培养的成骨细胞、MTT实验及结晶紫染色实验发现,喷砂处理组钛合金种植体样品并未表现出细胞毒性,并且喷砂处理组钛合金种植体样品表面的成骨细胞黏附及生长状况明显优于Ti-6Al-4V对照组,这说明经过喷砂表面改性处理可以明显促进成骨细胞的黏附及生长。究其原因,本研究分析这是由于喷砂表面改性处理改变了原有钛合金种植体材料的表面形貌,即增加了粗糙程度,从而促进了细胞的黏附与生长,这也与以往的研究结论[11-13]相一致。材料表面粗糙的形貌特征在一定程度上可以促进成骨细胞的生长与分化[14-19]。而成骨细胞的生长、分化与成骨细胞所分泌的ALP密切相关,ALP在成骨细胞的生长、分化及以后的矿化过程中起到了极其重要的作用,在一定程度上可以促进成骨细胞的生长、分化[20-23]。本研究通过对两组共培养的成骨细胞的ALP活性进行检测发现,喷砂处理组钛合金种植体样品表面的成骨细胞的ALP活性明显高于Ti-6Al-4V对照组,这提示喷砂表面改性处理可以通过提高成骨细胞的ALP的活性,间接促进成骨细胞的生长及分化。而喷砂表面改性处理之所以能够提高成骨细胞的ALP的活性,可能是由于喷砂表面改性处理增加了材料表面的粗糙程度,从而提高了成骨细胞的ALP的活性。

综上所述,与普通Ti-6Al-4V钛合金种植体材料相比,经喷砂表面改性处理的钛合金材料无细胞毒性,并且可以增强成骨细胞的黏附、生长及分化能力。然而,由于体外细胞实验与生物体内环境仍存在有差异,因此在今后的研究中,本课题组会相继开展一系列的体内动物实验来进一步加以证实。