彭媛 周徐 景宏舒 朱雪晶 史瑶平 王涛 崔丹 施东华 丁敏 鄢和新 翟博

人原代细胞可通过小分子组合逆转化为肝前体样细胞(HepLPC)，该细胞通过旁分泌作用可减轻动物的炎症反应并且促进组织再生[1,2]。为了进一步探究该细胞对炎症损伤环境及组织修复潜在调节作用及机制，现采用药物诱导原代巨噬细胞极化的体外模型进行评价，以期为该细胞治疗肝病的应用提供可靠的体外验证模型及参考依据。

材料与方法

一、材料与试剂

冷冻保存的原代肝细胞购自上海瑞德肝脏有限公司；高糖DMEM培养基、青链双抗、1640培养基购自上海源培生物科技股份有限公司；Trizol、Sybgreen、红细胞裂解液购自上海碧云天生物科技公司；胎牛血清购自以色列Biological Industries公司；相关引物由上海华津生物合成。0.25% Trypsin-EDTA 购自美国Gibco公司；小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)及白介素4(IL-4)购自上海近岸生物；脂多糖购自美国Sigma公司；F4/80、CD11c、CD206抗体购自美国Biolegend公司；IL6、IL1β、iNOS、IL10 ELISA试剂盒均购自联科生物。

二、实验方法

(一)肝细胞来源的肝前体样细胞条件培养基的制备 将冷冻保存的原代肝细胞，置于37℃水浴锅中快速解冻离心处理，将细胞培养在含有10%胎牛血清和2%青链双抗的肝细胞增殖培养基(TEM)中，然后将细胞置于37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中。每2～3天更换一次新鲜TEM培养基；当细胞覆率超过80%时使用0.25%的Trypsin-EDTA进行消化，并按照1∶3的比例接种入新的培养皿中。当细胞培养扩增到P3时，镜下观察细胞汇合率达80%，记录细胞状态，拍照并保存。将TEM培养基更换为无血清的高糖DMEM培养基，24 h后收获细胞上清，300×g离心10 min后分装保存于-20℃冰箱。……