王晓晗 韩 丰 沈 亮 陈云清 沈月玉 高 晨 侯震涛 冀子中 范竹萍

肝星状细胞(HSC)活化被认为是肝纤维发生的关键[1]。HSC的活化过程包括早期的启动激活和后期的持续性激活，短时间的肝损伤可引起HSC的启动激活，而慢性炎性反应是HSC持续激活的基础[2]。有研究发现，肝内脂质沉积引起的氧化应激等脂毒性表现与肝纤维化进展有关[3]。A20作为调控炎性反应的一种重要蛋白，在炎性反应激活后可被诱导表达，其对炎性反应的调控作用已被深入研究[2,4-6]。本研究主要探究A20、主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关基因A(MⅠCA)、MⅠCB在脂肪变HSC中的表达及作用。

1 材料与方法

1.1 脂肪变HSC的制备

取油酸(不饱和脂肪酸)和软脂酸(饱和脂肪酸)比例为2∶1的混合脂肪酸(FFA)，配置物质的量浓度为0.5 mmol/L，实验组采用FFA刺激人HSC LX-2细胞(购自ATCC)24 h，以诱导其发生脂肪变，对照组不予FFA刺激，留取细胞备用。

1.2 油红O染色

FFA作用于LX-2细胞24 h后，弃去培养皿中的培养液，用PBS漂洗。加入4%多聚甲醛固定30 min，蒸馏水洗涤。油红O液浸染30 min，显微镜下观察染色情况。蒸馏水洗涤，60%乙醇浸洗细胞5～10 s。蒸馏水洗涤，苏木素染液浸染20 s，水洗，干片，拍照。

1.3 RNA分离及实时荧光定量PCR

取实验组和对照组LX-2细胞，漂洗后加入1 mL TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA(37 ℃ 15 min，84 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min)，实时荧光定量PCR(real-time qPCR)法分析A20、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅲ型胶原、MⅠCA、MⅠCB的mRNA表达。总反应体系共10 μL，步骤为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。逆转录试剂盒、SYBR qPCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。以β-actin作为内参，采用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量。所有实验均重复3次。……