肖文田，秦丽敏，刁玉梅，刘晶劼，王丽强

解放军总医院第一医学中心 眼科，北京 100853

角膜是眼球最前端的无血管高度透明结构，分为5层，最外层为角膜上皮，由于直接暴露于外界环境，容易受到各种理化因素刺激而损伤，其再生主要依赖于角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSCs)[1]。角膜盲是我国第二大致盲原因，约70%角膜盲由角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency，LSCD)导致，主要表现为持续上皮缺损、新生血管入侵和角膜结膜化等[2]。近年来，随着角膜缘上皮干细胞标志物的出现及培养技术和培养载体的不断更新提高，利用细胞移植治疗此类疾病成为研究热点。目前，有多种不同方法用于诱导多能干细胞分化为角膜上皮细胞(corneal epithelial cells，CECs)。拟胚体是诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)或胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外一定培养条件下形成的球状结构，其形态与哺乳动物早期胚胎发育阶段高度相似，具有向内、中、外3个胚层分化的潜能。本研究选用TGF-β通路抑制剂SB505124及经典Wnt信号通路抑制剂IWP-2两种小分子化合物作用于拟胚体，阻断TGF-β和Wnt通路，同时联合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)激活FGF通路，模拟了早期胚胎发育，使人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)向 外 胚层、体表外胚层方向分化，最终分化为角膜上皮细胞，为治疗角膜盲提供了基础实验准备。

材料和方法

1 细胞、试剂及仪器 人胚胎干细胞H9细胞系(hESCs H9)购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司；基质胶(Matrigel)、超低黏附6孔板(Corning公司)；mTeSR1培养基、AggreWellTMEB Formation培养基、Y27632、AggreWellTM800 6孔板(Stemcell Technologies公司)；DMEM/F12、非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)溶液、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)溶液(Gibco公司)；β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、Accutase溶液(Sigma公司)；……