骆维 孟宪勇

摘要：目的：建立高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定大黄七味酊中主要成分大黄素和大黄酚含量的方法。方法 采用HPLC的方法，色谱柱为Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5?m），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（80：20），流速1.0 ml.min-1，柱温35℃，检测波长254nm，进样量为20 μl。结果 大黄素、大黄酚的线性范围分别为2.04μg.mL-1～24.48μg.mL-1（r2 = 0.9995）、2.00μg.mL-1～24.00μg.mL-1（r2 = 0.9993），精密度、重复性和稳定性试验均符合要求。大黄素、大黄酚回收率大于95%，RSD在0.23%～1.15%（N=9）。结论 HPLC测定大黄七味酊主要成分含量方法简便灵敏，准确度高，稳定性好，可用于大黄七味酊的质量控制。

关键词：大黄七味酊;高效液相色谱法;质量控制

【中图分类号】R246.7  【文献标识码】A  【文章编号】1673-9026（2021）06-154-02

0引言

大黄七味酊是武汉特勤疗养中心使用近四十年的医院制剂，获得非标准制剂批文（总制字（2016）F606011），现已被《中国人民解放医疗制剂规范》（2015版）第一部所收载。该制剂为复方制剂，包含羊蹄、虎杖、当归、雷公藤、辣椒、蛇床子、大黄7味中药饮片粗粉的70%乙醇浸泡液。其具有清热解毒，活血止痛，杀虫止痒之功效[1]。临床上主要用于治疗银屑病、湿疹及皮炎等皮肤疾病[2]。2012年医院申请全军非标准制剂质量标准提高获面上课题经费支持。本文参照《中国药典》等，建立了HPLC色谱法，检测该制剂中主要中药成分大黄素和大黄酚的含量，根据实验结果制定大黄七味酊中含大黄素和大黄酚的总量不得少于0.18 mg.ml-1作为其质控标准。

1材料

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent Technologies Inc.），Chem Staus色谱工作站（美国Agilent Technologies Inc.）;AUW220电子天平（日本Shimadzu公司）;AS3120型超声清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

大黄七味酊（141107、141118），由武汉特勤疗养中心疗养四区制剂室配制;大黄素对照品（纯度98.7%，批号：0756-200110）大黄酚对照品（纯度99.2%，批号：110796-201017），购自中国食品药品检定研究院;磷酸为分析纯，甲醇为色谱纯。

2方法和结果

2.1  色谱条件  色谱柱： Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5?m），美国Agilent公司;流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80：20）;流速1.0 mL.min-1;柱温35℃;检测波长为254nm;进样量为20 μL。

2.2 对照品溶液的配制   精密称定大黄素10.2mg置50mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成含204μg.mL-1的大黄素对照品储备液。精密称定大黄酚10.0mg置50mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成200μg.mL-1的大黄酚对照品储备液。

2.3供试品溶液的制备  精密量取大黄七味酊5mL，置锥形瓶中，蒸干，精密加甲醇25mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置圆底烧瓶中，挥去溶剂，加2.5mol.L-1硫酸溶液10 mL，超声处理（功率120W，频率45kHz） 5min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流l小时，冷却，移至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次10mL，合并三氯甲烷液。三氯甲烷液用铺有无水硫酸钠2g的漏斗滤过，合并三氯甲烷液，回收溶剂至蒸干，残渣精密加入甲醇25mL，称定重量，置水浴中微热溶解残渣，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得[3]。

2.4阴性样品溶液的制备  按处方称取药材（除去大黄、羊蹄），按制备工艺制备缺大黄素和大黄酚的样品，再按“2.3供试品溶液的制备”，配制阴性对照品溶液。

2.5 专属性考察  在“2.1”色谱条件下，大黄素和大黄酚对照品、供试品中大黄素和大黄酚的保留时间分别约为9.69min，13.75min，阴性样品溶液在上述保留时间没有峰值，所以其他成分对测定无干扰，见图1。

2.6  线性与范围  分别精密量取大黄素、大黄酚对照品储备液0.5、1、1、2、5、3mL，分别置于50、50、20、25、50、25mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为线性测试溶液。精密量取以上测试溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，计算回归方程及相关系数。结果见表1和图2。

2.7  中间精密度试验  测试溶液的制备：在不同的检查日期，不同的试验人员，按“2.3供試品溶液的制备”法将供试品（批号：121107）溶液配制6份，作为测试溶液。按“2.1”色谱条件进样分析大黄素和大黄酚含量，大黄素和大黄酚各6次测定结果的RSD分别为0.93%、0.79%，结果表明本品测定方法中间精密度良好。

2.8  精密度试验  精密量取大黄素、大黄酚混合对照品溶液（每mL含大黄素16.32μg.mL1、大黄酚16.00μg.mL-1）20?L，注入液相色谱仪记录色谱图，连续进样6次。计算峰面积的相对标准偏差（RSD%值），大黄素、大黄酚对照品溶液连续进样6次的主峰面积RSD%分别为0.11%、0.09%，表明仪器精密度良好。结果见表2。

2.7  重复性试验  取同一批次（批号：121107） 样品5mL，按“2.3供试品溶液制备”配制供试品溶液，平行配制6份供试品溶液。在“2.1”色谱条件项进样分析，按外标法以峰面积计算各份供试品的含量，测得大黄素、大黄酚含量RSD分别为1.07%、0.90%。表明本方法的重复性良好。

2.8  加样回收率试验  测试溶液的制备：取同一批号（批号：121107） 1mL，精密吸取大黄素、大黄酚对照品储备液适量，置锥形瓶中，蒸干，按“2.3供试品溶液的制备”项下方法操作，制备低、中、高3个浓度的溶液，每个浓度平行配制3份作为准确度测试溶液。按“2.1”色谱条件进行进样分析，测定大黄素、大黄酚的含量，计算加样回收率，大黄素、大黄酚低、中、高3个浓度的加样回收率均高于95%，RSD%均低于2%，表明本含量测定方法的可行。结果见表3

2.9  稳定性试验  取本品（批号：121107）5mL按“2.3供试品溶液的制备”方法，配制供试品溶液，室温放置。分别于0、2、4、6、8、12小时取样，按“2.1”色谱条件下进样分析测得大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.64%，0.88%（n=3）。表明供试品中大黄素和大黄酚在室温12h内稳定。

2.10 含量的测定  分别取2批次（批号：141107、141118）独立包装大黄七位酊5mL，按“2.3供试品溶液的制备”方法处理，制备供试品溶液。按“2.1”色谱条件测定大黄素、大黄酚含量，每批次平行测定3次，结果见表4

3讨论

通过紫外可见分光光度计扫描功能，对规定含量的大黄对照品、大黄酚对照品和阴性溶液进行光谱扫描，由光谱图可看出，大黄素在波长200～220nm、240～310nm有较大吸收，大黄酚在波长210～230nm、240～270nm有较大吸收峰，阴性样品溶液在波长250～300nm之间无辅料、溶剂的吸收。结合《中国药典》综合考虑，选择254nm作为测定波长。在该波长下待测成分均出峰且峰型良好，响应值较高，基线平稳[4-5]。

本试验建立了一种可以测定医院非标准制剂大黄七味酊中大黄素、大黄酚含量的方法，考虑中药材原产地不同、浸泡时间不同等，故将大黄素和大黄酚的总含量不少于0.18μg.mL-1 作为该制剂的质量标准。该方法灵敏、准确、重复性好，可作为大黄七味酊的质量控制方法。

参考文献：

[1]孟飞，宋学立.白蔹药材中大黄素含量的反相高效液相色谱法测定[J].药学实践杂志，2020，38（03）：264-267.

[2]蔡天進，刘金来，杨金招，朱雪琼，金瓯.消肿解毒膏中大黄素、大黄酚的含量测定[J].海峡药学，2020，32（02）：60-62.

[3]张宪，李岳.高效液相色谱法同时测定麻仁丸中大黄素、大黄酚、大黄酸及厚朴酚含量[J].国际中医中药杂志，2019（10）：1107-1110.

[4]吴勇，刘燕，陈卫东，王雷.高效液相色谱法同时测定大黄碳酸氢钠片中5种成分的含量[J].中南药学，2019，17（10）：1718-1720.

[5]文花，刘燕，董武，白玉霞.HPLC法同时测定蒙药给喜古讷-6中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量[J].中国民族医药杂志，2019，25（08）：41-43.

武汉特勤疗养中心  湖北武汉  430000

课题编号：14ZJZ07-1

课题题目：皮肤病外用非标准制剂标准提高的研究