王磊 霍彬 霍小东 综述 王海涛 审校

溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）是一种新型肿瘤免疫疗法，通过不同的调控机制在肿瘤细胞内复制、裂解肿瘤细胞，而不影响正常细胞生长[1]。目前，OVs可分为腺病毒（adenovirus，AD）、痘病毒、疱疹病毒、呼肠孤病毒和柯萨奇病毒等[2]；给药方法有瘤内注射、静脉输送、胸腹腔和膀胱内注射、细胞载体四种[3]。OVs技术代次：第一代，仅具有肿瘤特异性，如H101、Reolysin和Telomelysin；第二代，具有肿瘤特异性，含有1个功能性外源基因的表达，如T-VEC、JX-594和H102；第三代，具有肿瘤特异性、免疫调节与免疫治疗功能，多于1个功能性外源基因的表达，外源基因功能相互协调，如GO701和GV802。

1 OVs抗肿瘤治疗现状

近年来，随着医疗水平的提升及技术的成熟，OVs越来越频繁地应用于抗肿瘤治疗，为广大恶性肿瘤患者带来希望。抗肿瘤疗法中，目前最常用的2种OVs是重组人5型腺病毒（安柯瑞，H101）与T-V EC（talimogene laherparepvec）。H101是一种经基因改造的溶瘤腺病毒，于2005年被中国 国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准用于联合化疗治疗鼻咽癌，是世界上最早的一款OV。T-VEC是第二代单纯疱疹病毒Ⅰ型，于2015年被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗不能手术的黑色素瘤，随后于2016年在欧洲获得批准[1]。OVs疗法的肿瘤特异性通常依赖于在癌细胞中有缺陷的IFN反应；而过度刺激IFN，可使OVs被免疫系统更快地清除，限制了直接的溶瘤[4]。Meta分析[5]表明，与传统疗法相比，OVs联合疗法具有较高的客观缓解率（objective response rate，ORR）。在2017年所有临床试验中，有78项是OVs用于多种恶性实体瘤中的干预试验，这表明OVs具有较好的抗肿瘤研究前景[2]。

2 OVs抗肿瘤作用机制

OVs感染肿瘤细胞后，突破细胞防御机制，复制、繁殖、裂解肿瘤细胞，释放大量子代病毒攻击邻近肿瘤细胞，再次复制、裂解细胞。若肿瘤细胞全部裂解，病毒因自身缺陷无法复制，被免疫系统清除。

OVs破坏肿瘤细胞的机制：1）直接裂解肿瘤细胞。OV在肿瘤细胞内增殖，抑制肿瘤细胞。释放的子代病毒感染邻近的肿瘤细胞；2）病毒蛋白的直接细胞毒性作用，如AD E3区编码的ADP；3）抗肿瘤免疫反应。在非特异免疫方面，病毒增强肿瘤细胞对多种细胞因子的敏感性。在特异性免疫方面，病毒感染肿瘤细胞后诱发的免疫，可防止肿瘤复发；4）增强肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性；5）转基因表达。将外源性基因插入到病毒基因组中，将重组病毒感染肿瘤细胞并表达所插入的治疗基因，发挥抗肿瘤作用。另外，将某些药物前体转化酶基因插入到AD基因组以杀伤肿瘤细胞。

2.1 OVs在肿瘤细胞内的选择性复制

OVs选择性复制的机制[3,6]：1）利用肿瘤细胞表面特异性受体与病毒表面蛋白，通过受体-配体途径特异性结合，实现病毒对细胞的靶向感染；2）将基因转录过程置于组织或肿瘤特异性启动子的控制下，实现选择性复制；3）免疫反应缺陷的肿瘤细胞易受到病毒感染；4）病毒抑制宿主细胞凋亡。

2.2 OVs抗肿瘤免疫反应

OVs感染肿瘤细胞后，引起局部抗病毒炎症，使机体产生免疫[2]。由于多数肿瘤处于免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中，抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APCs）功能被破坏，无法递呈肿瘤相关抗原，肿瘤固有的β-catenin致癌信号通路抑制APCs在肿瘤部位的募集[7]。病毒感染后，IFN、Toll样受体激动剂、危险相关分子模式（dangerassociated molecular patterns，DAMP）和病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）因子的局部释放有助于逆转抑制性TME，将肿瘤置于促进抗肿瘤免疫反应的环境。DAMP和PAMP通过结合识别受体（Toll-like receptors，TLR），促进先天性免疫反应。此外，OV感染APCs，促进其成熟，肿瘤细胞裂解后释放肿瘤相关抗原，诱导抗肿瘤CD8+T细胞免疫反应。

基因修饰的OV更易改善抗原提呈，促进T淋巴细胞的激活。T-VEC是一种基因修饰的Ⅰ型HSV（her pes simplex virus 1，HSV-1），是第一种对黑色素瘤显示临床疗效的OV。在HSV-1的连续传代过程中，分离1个带有易位US11基因的突变体，导致ICP47缺失[8]。ICP47结合抗原加工和呈递相关转运蛋白，限制抗原呈递，防止抗原加载到MHC-1分子中。而在T-VEC中，删除ICP47，增强抗原呈递，维持感染的肿瘤细胞表面MHC-1抗原的表达[8-9]。为了提高TVEC的免疫原性，将人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）基因插入到缺失ICP34.5基因组位置[9]。GM-CSF是一种调节性细胞因子，促进炎症部位树突状细胞（dendritic cell，DC）的蓄积，引发T细胞反应。在鼠类肿瘤研究中，含有ICP34.5和ICP47缺失的JS-1病毒使注射部位的肿瘤消退，但不能使对侧肿瘤消退。将GM-CSF纳入病毒设计后，总体存活率显著提高[1,8-9]。ICP34.5的缺失、USL11的早期表达、ICP47的缺失以及局部GM-CSF的表达有助于改善宿主抗肿瘤免疫。

OVs感染的肿瘤细胞具有高度免疫原性。肿瘤细胞裂解后释放肿瘤相关抗原、细胞因子和趋化因子，诱导全身肿瘤特异性免疫反应，消除局部及远隔部位未感染的癌细胞。插入编码细胞因子的基因，如GMCSF、Fms样酪氨酸激酶3配体（FLT3L）或趋化因子（CCL3、CCL5）增强OV诱导的肿瘤特异性免疫反应。与GM-CSF相似，FLT3L是一种体内募集和扩增DC的生长因子，表达FLT3L的OV触发DC和T细胞向局部肿瘤浸润，增强抗肿瘤和抗病毒免疫反应[10]。另一方面，基因改造后的OVs表达炎性趋化因子，如CCL5、CCL3和CCL19，增加肿瘤浸润免疫细胞数量，改善体内治疗效果，增加肿瘤内OVs作用的持久性。

部分OVs单独治疗时，虽然在注射性皮肤病变和非注射性皮肤病变中疗效较好；但是，在远处内脏病变中的缓解情况仍然较差。因此，亟需寻找更优的联合疗法。

3 OVs联合治疗策略

OVs是一种多功能抗癌药，选择性感染、复制并杀死肿瘤细胞，该过程取决于表面受体、肿瘤细胞对病毒复制的允许性。OVs在多个临床试验中显示出不同的治疗效果，但很少长期诱导体内肿瘤的完全消退。而且，异质性肿瘤的选择性压力导致对OV的抗性。为了克服这些不足，临床上建立起许多新颖OV联合疗法，增强对肿瘤的杀伤力。

3.1 OVs联合化疗或靶向治疗

化疗直接杀死恶性细胞，增强肿瘤细胞免疫原性，增强OVs的细胞毒性；OVs联合化疗具有协同作用，促进抗肿瘤免疫反应[11]。OVs联合化疗的机制包括：1）逃避抗病毒免疫反应，增强病毒溶瘤作用，改善HSV、AD、麻疹病毒和呼肠孤病毒抗肿瘤功效；2）抵抗免疫抑制肿瘤微环境。TME主要组成部分是调节性T细胞（regulatory cells，Treg）和骨髓来源抑制性细胞（my eloid-derived suppressor cells，MDSC），二者有效降低肿瘤免疫性。研究表明，TME内MDSC积累，抑制抗肿瘤效应T细胞，促进肿瘤生长；吉西他滨、舒尼替尼、5-Fu等许多化学药物清除MDSC，提高生存率[12-13]。3）调节肿瘤细胞免疫原性。阿霉素和Ara-C降低免疫检查点分子的表达，阻断其对浸润T细胞的抑制。化疗药物影响多个生物过程，如雷帕霉素及其类似物改变mTOR信号传导，增加OVs靶向性，诱导自噬。

OVs联合化疗或单药治疗肿瘤均优于化疗。评估37例头颈部肿瘤患者中腺病毒ONYX-015与顺铂、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）联合抗肿瘤疗效，结果表明患者ORR为53%，优于任何一种药物单独治疗[14]。Lu 等[15]研究表明，H101联合化疗治疗多种实体瘤的总有效率为30.4%，而化疗仅为13.0%（P＜0.05）。Lin等[16]研究发现，H101联合肝动脉插管化疗栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）治疗肝癌患者，总有效率达到60.9%，总生存期（overall survival，OS）为12.8个月；TACE组有效率仅为36.4%，OS为11.6个月（均P＜0.05）。HSV-1联合顺铂治疗17例头颈癌患者，ORR为82.3%，完全缓解率为93%，疾病特异性生存率为82.4%[17]。OV联合化疗用于头颈癌、食管癌、肺癌、肝癌等实体瘤时，可提高总有效率，延长患者生存期，安全性良好，以发热、呕吐、感冒样症状居多，无严重不良反应。另外，OVs单药疗效优于化疗。杨帆等[18]研究发现，H101治疗晚期肺癌时，总有效率达到69.23%（化疗53.84%；P＜0.05），不良反应无严重差异；Pexa-vec和化疗分别用于肝癌时，平均OS为14.1个月vs. 6.7个月，患者耐受性良好[19]。

与联合化疗的原理相同，靶向治疗抑制癌细胞内异常的信号通路。联合使用BRAF、MRK激酶抑制剂和3型呼肠孤病毒[reovirus type 3 （Dearing），RT3D]，通过细胞凋亡体外杀死细胞。RT3D联合细胞毒性药物的研究表明，RT3D安全、可耐受，将RT3D与常规抗癌药物联合使用，实现协同作用[20]。

3.2 OVs联合放疗

OVs和放疗是肿瘤治疗的两个不同领域，具有不重叠的细胞毒性谱。辐射增强病毒的溶瘤作用，病毒提高细胞放疗敏感性，二者具有协同作用[11,21]。OVs是一种极具潜力的肿瘤治疗策略。最初认为OV的细胞毒性是增加病毒复制、增强肿瘤细胞感染和溶瘤作用，但目前许多OV研究数据均不支持这一假设；大多认为OV阻止DNA修复，使肿瘤细胞对辐射敏感，诱导细胞凋亡。

OVs与放疗联合抗肿瘤，疗效显著。高度减毒的牛痘病毒（VV，GL-ONC1）结合放疗，可提高抗肿瘤疗效[21]；高剂量放疗增强腺病毒在前列腺癌细胞内的复制，抑制癌细胞的增殖。与单独治疗相比，HSV-1联合放疗对疾病预后有明显改善作用；NVl066联合放疗显著缩小非小细胞肺癌和恶性间皮瘤的肿瘤体积[22]。RT3D联合放疗用于晚期实体瘤，根据不同放疗剂量进行分组，结果发现在低剂量组中，2例部分缓解（partial response，PR），5例疾病稳定（stable disease，SD）；而在高剂量组，5例PR，2例SD[23]，这表明RT3D联合放疗的耐受性良好。G207联合放疗治疗9例胶质瘤患者，有6例达到PR或SD，注射G207至死亡的中位生存时间为7.5个月，表明单剂量HSV-1联合放疗疗法具有安全性和临床疗效潜力[24]。

OVs可同时联合放化疗用于抗肿瘤。静脉注射GL-ONC1联合放化疗治疗19例头颈癌患者，中位随访30个月，1、2年无进展生存率分别为74.4%和64.1%，生存率分别为84.6%和69.2%[25]。AdV-tk与放化疗联合治疗8例脑瘤患者，未发现剂量限制性毒性，3例患者存活超过24个月；2例患者疾病无进展，分别生存37.3个月和47.7个月，证明AdV-tk联合放化疗有一定的安全性与疗效[26]。一项正在进行的Ⅰ期OV试验，将DNX-2 401注射到儿童胶质瘤患者的小脑脚，2～6周后进行放疗和化疗，期待该疗法能够提高患者的生存质量，延长患者生存期[27]。

3.3 OVs联合免疫治疗

OVs虽然能够快速减少局部肿块大小，但不易产生持续性抗肿瘤免疫应答。免疫应答是OV疗法的关键组成部分，初始诱导很强，随后效应细胞的抗肿瘤活性被多种免疫调节剂（如CTLA-4和PD-L1）抑制。在恶性黑色素瘤小鼠模型中，溶瘤麻疹病毒将抗CTLA-4和抗PD-L1抗体，靶向递送至TME，诱导较强的特异性抗肿瘤免疫反应，未发现免疫相关毒性[28]。另一种黑色素瘤小鼠模型中，瘤内注射NDV联合抗CTLA-4抗体导致肿瘤消退，存活时间延长[29]。PDL1产生于肿瘤细胞和浸润肿瘤细胞的过表达，与T细胞上的PD-1结合，诱导T细胞凋亡[28-29]，使肿瘤细胞逃逸；而阻断PD-1改善T细胞功能。OV感染增强免疫调节剂的表达，增强肿瘤细胞对PD-1或PDL1阻断的敏感性，引起抗肿瘤免疫反应。因此，OVs联合免疫具有治疗价值。

抗肿瘤免疫对全身肿瘤有效。联合疗法增加肿瘤内CD8+T细胞浸润，可能吸引肿瘤特异性T细胞，逆转对PD-1阻断疗法的耐药性[30]。OV瘤内给药后CD4+和CD8+T细胞全身性增加，CD8+T细胞表达PD-1、增加对肿瘤的浸润；而肿瘤细胞表达PD-L1，可能限制了OV单药的抗肿瘤活性，临床活性优于单独使用任何一种疗法的预期。Ribas 等[31]研究表明，TVEC用于21例晚期黑色素瘤患者的ORR为62%，完全缓解率为33%，表明OV疗法通过改变TME来提高抗PD-1免疫的疗效。T-VEC与伊匹单抗联合治疗黑色素瘤患者的ORR为39%，而伊匹单抗单药组仅为18%，表明T-VEC增强伊匹单抗的疗效[32]；18个月的无进展生存率为50%[33]。近期Shi等[34]研究表明，一种重组溶瘤5型腺病毒（删除E1B与E3基因片段、插入hTERTp-人类端粒酶逆转录酶启动子至E1a 基因上游以控制病毒复制、保留OV的E1A基因片段）联合抗PD-1抗体、CSF抑制剂治疗小鼠结肠癌，增加CD4+与CD8+T细胞的比例，增加肿瘤T细胞浸润，促进肿瘤消退，延长生存期。由于这种重组溶瘤5型腺病毒的结构与安柯瑞相似，这表明安柯瑞联合PD-1免疫疗法在抗肿瘤方面的潜能巨大。溶瘤腺病毒编码趋化因子CCL5和IL-15，触发肿瘤新抗原的释放和抗原决定簇的扩散，提高对肿瘤的杀伤力。

个体化的抗肿瘤免疫疗法。1项H101结合局部加热治疗5例肿瘤患者的研究表明，2例患者注射灶、非注射灶肿瘤完全消退而长期生存，3例患者非注射病灶有不同程度缓解后死亡，生存期分别为29、15、13个月（表1）[35]。肿瘤病灶局部注射H101，肿瘤细胞破坏时，释放出个体特异性的多种肿瘤抗原；加温注射病灶，诱导内源性HSP（HSP70和gp96）表达，与多种肿瘤抗原结合，并通过DC上特异性受体递呈给不成熟的DC[6]，提高了H101的局部疗效。此法将OV与免疫治疗有机结合起来，优化抗肿瘤免疫反应，使机体形成针对自身肿瘤抗原的特异性细胞免疫反应，获取最佳疗效。

表1 OVs主要临床研究汇总

4 结语

为寻求更好的OVs抗肿瘤方法，未来需要更加深入地研究OVs、肿瘤细胞及机体免疫系统之间复杂的相互作用关系。目前，仍存在较多问题需要解决，如患者免疫状态、恶性肿瘤类型、肿瘤突变谱、OVs载体种类等因素与患者对病毒疗法的应答之间的关系等。解决上述问题需要更为广泛更加深入的基础研究和临床试验，以寻求更为有效和更具个体化的肿瘤治疗方法。综上所述，最有效的抗肿瘤方案可能源于联合不同的肿瘤破坏机制，这亟需进一步的研究证实。