李雨虹，耿鹏，刘建民，时祎，辛瑜，石贵阳，张梁*

1(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122) 3(山东惠仕莱生物科技有限公司，山东 济南，250101)

钙二醇钙二醇(25-hydroxy vitamin D3, 25-OH VD3)是VD3的羟基化衍生物[1]，其制剂产品在临床上主要对慢性肾脏疾病、高血糖症、胆汁淤积性肝病有预防作用，并且可以治疗老年骨质疏松症，因此有较好的发展前景[2-4]。25-OH VD3的制备方法主要有化学合成法及微生物转化法，微生物转化法因其高选择性、作用温和等优点，引起了诸多学者的关注[5-6]。在微生物中，一般通过VD3羟化酶(VD3hydroxylase，Vdh)对VD3进行羟基化，使无生物活性的脂溶性激素原VD3转化25-OH VD3，进而发挥其生物活性[7-9]。

Vdh基因最初发现于一种稀有的放线菌-自养无支梭菌(Pseudonocardiaautotrophica)中，该菌株具备将VD3羟化为25-OH VD3的能力[10-11]。KANG等[12]利用Pseudonocardiasp.KCTC 1029BP的细胞作为全细胞催化剂转化VD3，成功制备出61.87 mg/L的25-OH VD3，但是由于野生菌转化时间长达9 d，且产物种类众多，不利于后续分离纯化。ABDULMUGHNI等[13]采用基因工程的方法异源表达Vdh，在巨大芽孢杆菌MS941中使用牛肾上腺毒素还原酶和肾上腺毒素体外系统建立了转化VD3的方法，虽然这种方法有效的降低了转化时间，但巨大芽孢杆菌作为宿主菌的安全问题有待进一步探讨。

本研究选择枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为VD3羟化酶的宿主，其属于食品级安全微生物(generally recognized as safe，GRAS)[14]，而且生长条件简单，易于培养，周期短，便于工业上大规模的高密度发酵应用生产，广泛应用于食品及医药等领域[15]。本工作首先构建了重组枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB600/pMA5-vdh，采用CO差光谱法对表达后的酶进行酶活力检测。……