石卫红，李小林，熊清华，万冠群，曾 琪，胡云刚，覃 煦

（江西省人民医院整形颌面外科，江西 南昌，330006）

肥胖是指机体脂肪积累过多，与其他组织失去正常比例的一种状态[1,2]。近些年来，随着经济发展及人们生活方式的转变，全球肥胖率呈持续上升趋势，因此预防肥胖成为全球面临的最大的公共卫生挑战。瘦素是一种功能广泛、多靶器官的内分泌激素，与肥胖、高血压、骨代谢、Ⅱ型糖尿病等生理病理过程密切相关[3,4]。目前研究认为脂肪体积的大小决定了瘦素合成量的多少，因此，瘦素对肥胖和肥胖相关的疾病有直接的影响[5]。所以，在肥胖治疗和预防方面瘦素具有显著的研究前景，但相关报道较少，所以本研究将探讨瘦素对肥胖饮食小鼠脂质合成相关基因表达的影响，为瘦素的临床应用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

16只清洁级C57BL/6小鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可许可证号：SCXK（湘）2016-0002）。

1.2 实验试剂与仪器

瘦素（厂家：MedChemExpress，批号：#25973）；高脂饲料（南京盛名科研动物有限公司）。Trizon Reagent（CW0580S，CWBIO 康为世纪）；Ultrapure RNA 超纯RNA提取试剂盒（CW0581M，CWBIO 康为世纪）；HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒（CW2569M，CWBIO 康为世纪）；UltraSYBR Mixture（CW0957M，CWBIO 康为世纪）。微型离心机（D1008E，SCJLOGEX）；旋涡混合器(XH-C，常州越新仪器制造有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-1600PC，上海美谱达仪器有限公司）；低温高速离心机（TGL-16G，常州中捷实验仪器制造有限公司）；荧光PCR仪[CFX Connect™实时，伯乐生命医学产品（上海）有限公司]。

1.3 实验分组

随机将16只C57BL/6小鼠分成4组，每组4只，正常对照组、高脂膳食组、高脂膳食瘦素0.5mg/kg组、高脂膳食瘦素1mg/kg组。其中高脂饲料：普通饲料79%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇1%。

1.4 动物造模及给药[6,7]

正常对照组：给予普通饲料喂养8周后，继续普通饲料喂养4周，同时每天灌胃0.1ml/10g生理盐水，每天1次，连续4周。高脂膳食组：高脂饲料喂养8周后，继续高脂饲料喂养4周，同时每天灌胃0.1ml/10g生理盐水，每天1次，连续4周。高脂膳食瘦素0.5mg/kg组、高脂膳食瘦素1mg/kg组：高脂饲料喂养8周后，继续高脂饲料喂养4周，同时每天分别对大鼠灌胃，灌胃剂量分别为0.5、1 mg/kg，每天一次，连续灌胃4周。

1.5 取材

连续灌胃4周结束后，将4%水合氯醛注射到小鼠腹腔，后剪断小鼠下腔静脉，充分放出血液并吸干血液，用镊子捏住边缘系膜结构将整个肝脏小心取出来，取肝脏中叶放于液氮罐中速冻30 min，每个肝脏多冻存几份，转移到-80℃冰箱，用于蛋白基因的提取。

1.6 Realtime PCR

提取RNA，将RNA通过逆转录HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，计算出各组FAS、ACC-1、PPARγ、SREBP-1的相对表达量。操作体系:RNase Free dH20 9.5μL、cDNA 1 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Rrimer 1 μL、2×qPCR Mixture12.5 μL。反应程序，三步法：预变性：95℃、10min，变性：95℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、30s，40个循环。融解曲线分析：95℃、15s，58℃、1min，95℃、15s，58℃、15s，58℃、15s，95℃、0.5s。引物如表1。

表1 引物

1.7 统计学方法

应用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有实验重复3次，定量结果采用均数±标准差（）表示。两组之间定量数值比较采用独立样本T检验，多组之间定量数值比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-K法。检验水准α=0.05。

2 结果

各组小鼠肝脏组织中PPARγ、ACC-1、FAS、SREBP1 mRNA表达量的测定结果与正常组比较，高脂肪组小鼠肝脏组织中PPARγ、ACC-1、FAS、SREBP1 mRNA表达量均显著下调（P＜0.01）；与高脂肪组比较，瘦素低、高剂量组小鼠肝脏组织中PPARγ mRNA表达量上调，瘦素高剂量组中小鼠肝脏组织中ACC-1、FAS、SREBP1 mRNA表达量显著上调（P＜0.01）。见图1～9。

图1 PPARγ扩增曲线

3 讨论

肥胖是一种慢性疾病，是食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体内脂肪积聚过多造成体重过度增长的一种生理状态，也是心脑血管疾病、Ⅱ型糖尿病、肿瘤等疾病的重要因素，是导致早死、致残，影响人们生命健康及经济负担的重要公共卫生问题[1,8]。随着研究的深入，认为高脂膳食引起的肥胖可能很大程度上是取决于机体能量代谢相关基因发生变化，从而使得脂质合成与分解、脂肪酸氧化代谢等异常[9-11]。

固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1）作为脂质合成的关键转录因子，被活化后能够启动下游靶基因脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-Coa carboxylase，ACC-1）等与脂质合成相关的关键酶合成，进而参与脂质的合成。FAS催化长链脂肪酸合成，ACC-1催化丙二酰辅酶A合成，因此在脂肪酸和甘油三酯的代谢过程中发挥重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR）是参与脂质合成、分泌及积累的转录因子。其中PPARγ促进脂肪代谢限速酶合成，进而增强脂肪代谢限速酶的抗脂质分解作用，使本该流向肌肉及肝脏的游离脂肪酸流向脂肪组织，进而减少糖异生。激活PPARγ后，脂质细胞不仅形态上发生一些变化，还会出现脂质的积累及胰岛素的敏感等现象。因此，通过调控PPARγ、FAS、ACC1、SREBP-1的表达对于肥胖引起的脂质积聚具有重要的意义。

1950年，Ingalls发现了一种会诱导肥胖和糖尿病的“肥胖基因”，后经过多年学者研究，利用定位克隆技术获得了肥胖基因，并将这种基因编码的细胞因子命名为瘦素（leptin）。瘦素由骨骼肌、心脏、胃黏膜、肝脏、胰脏、卵巢等部位产生和分泌，也可以由脂肪组织分泌，瘦素具有很强的亲水性，能够以单体形式存在于血浆中，并可以通过促进甘油三酯分解，抑制脂肪酸合成酶表达，最终发挥抑制脂肪合成的作用[12,13]。有研究发现将肥胖小鼠给予瘦素蛋白，发现肥胖小鼠的食物摄入量显著降低，解剖后也发现其脂肪组织量明显降低[14,15]。说明瘦素具有调节脂肪合成的作用。因此本研究进一步通过Realtitme PCR检测瘦素对肥胖小鼠肝脏组织中脂肪合成相关基因表达的影响，以进一步探讨其对脂质合成影响的机制。Realtitme PCR检测结果表明瘦素能够显著的上调PPARγ、FAS、ACC1、SREBP-1 mRNA表达，从而抑制肥胖引起的小鼠脂质积聚。

图2 PPARγ溶解曲线

图3 ACC-1扩增曲线

图4 ACC-1溶解曲线

图5 FAS扩增曲线

图6 FAS溶解曲线

图7 SREBP1扩增曲线

图8 SREBP1溶解曲线

图9 PPARγ、ACC-1、FAS、SREBP1 mRNA表达量柱状图与正常对照组比较，**P＜0.01；与高脂肪组比较，P＜0.01

另外有研究表明韩国济州岛红海菜（GEE）60%乙醇提取物对3T3-L1细胞和高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠具有抗脂肪活性。体内肥胖小鼠实验表明GEE能够显著降低脂肪生成蛋白SRBEP-1和PPARγ表达，进而降低肥胖小鼠体重及脂肪肝、血清甘油三酯、总胆固醇含量。体外实验表明GEE能显著降低3T3-L1细胞中PPARγ和C/EBPαmRNA表达，进而减少细胞内脂质的积累[16]。胶原肽喂养高脂饮食喂养的小鼠，SREBP-1、FAS、ACC1、SREBP-2及3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶（HMGCR））的蛋白表达水平显著降低，PPARα、肉碱棕榈酰转移酶1（CTP1））和胆汁酸（细胞色素P450家族7亚家族系成员1（CYP7A1））的合成提高，从而说明胶原肽具有抑制肥胖饮食小鼠脂肪堆积和调节脂质代谢的作用[17]。以上这些研究认为GEE、胶原肽有望成为治疗肥胖相关问题的药物，在结合本实验研究结果，进一步推测瘦素也可能成为治疗肥胖的新型药物。

综上所述，瘦素可以通过调节脂质合成相关基因表达影响肥胖饮食小鼠脂质代谢。但缺乏对其作用机制研究，本课题组下一步将对瘦素调节脂质合成相关基因表达具体机制进行深入探究，为瘦素临床应用提供理论依据。