陶 祥 张文斐 刘骏辉 朱晓楠 冀保卫 张 戈 徐海涛 陈治标

胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，具有侵袭性强、复发率高、预后差的特点[1～3]。胶质瘤细胞侵袭是一个复杂的过程，上皮-间充质转化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）在这一过程中起关键作用，而Snail homolog 2（SNAI2）和E-cadherin是EMT的关键分子[4]。研究表明多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1，LRIG1）抑制胶质瘤细胞侵袭[5]，但具体机制尚不清楚。还有研究表明LTIG1抑制EMT，从而抑制乳腺癌细胞侵袭[6]。本研究探讨过表达LRIG1对胶质瘤U251细胞侵袭、迁移的影响及EMT在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞培养及质粒转染U251细胞[中国科学院（上海）细胞库]用含10%胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所）的DMEM培养基（美国Gibco公司）培养。应用LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）试剂盒将质粒pLRIG1-GFP（pLRIG1-GFP组）及其空载pEGFP-N1质粒（pEGFP-N1组；武汉大学人民医院神经外科廖建明博士馈赠）转染U251细胞，G418挑选具有抗性的细胞并扩增，以供进一步实验。另选择不转染任何质粒U251细胞作为空白对照组。

1.2 qRT-PCR检测mRNA表达 使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA，并合成cDNA（42℃、60 min，70℃、5 min）。PCR扩增：预变性95℃持续1 min；循环35次95℃，15 s→58℃，20 s→72℃，20 s；末段延伸72℃持续5 min；溶解曲线72℃→95℃，每20 s升温1℃；依据ΔΔCT法处理结果。PCR引物（美国Invitrogen公司）：LRIG1正义链5'-CCGGGTGATACAACCTTGCT-3'，反义链5'-ACACCGAAGTGGACTGTTACTCC-3'；SNAI2正 义 链5'-CCCAGGCTCACATATTCCTTGT-3'，反 义 链5'-ACACCGAAGTGGACTGTTA CTCC-3'；E-cadherin正义链5'-ATAGTTCGAGGTTCTGGTATGGG-3'，反义链5'-ACTGGTGCCATTTCCACTCG-3'；GAPDH正义链5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'，反义链5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。

1.3 免疫印迹法检测蛋白表达 以RIPA裂解液提取总蛋白，标准曲线法测定蛋白含量，常规SDS-PAGE电泳与转膜。一抗处理4℃孵育过夜；二抗处理室温孵育1 h；然后ECL发光与显影。所用抗体：兔抗人LRIG1多克隆抗体（美国Abcam公司），兔抗人Ecadherin、SNAI2、N-cadheirn和Vimentin多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），鼠抗人LRIG1、SNAI2、GAPDH、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin单克隆抗体（美国Abcam公司）。

图1 pLRIG1-GFP质粒转染U251细胞……