刘 冰，胡诗艺，熊紫莹，韦 雪，周化岚，张建国

上海理工大学 医疗器械与食品学院 食品科学与工程研究所，上海 200093

毕赤酵母(Komagataellaphaffii,曾命名Pichiapastoris) 是能够利用甲醇作为唯一碳源生长的甲基营养型微生物，是目前一种重要的表达外源蛋白的工业微生物[1]。其过氧化酶体中的醇氧化酶1(AOX1)和醇氧化酶2(AOX2)将甲醇氧化为甲醛。醇氧化酶对甲醇和氧气的亲和力比较低[2,3]，因此，需要大量的醇氧化酶来代谢甲醇。但是PAOX1和PAOX2都受甲醇严格调控，调控机制相同[4,5]。毕赤酵母在含有葡萄糖、乙醇、甘油等碳源的培养基中生长时，PAOX1和PAOX2都被抑制，细胞中无法检测到AOX1和AOX2的mRNA[2,6-7]。PAOX1和PAOX2在甲醇为唯一碳源的培养基中表达。由于醇氧化酶2启动子(PAOX2)比醇氧化酶1启动子(PAOX1)弱，导致AOX2的含量只占总醇氧化酶量的5%[6,7]。AOX1的基因序列(aox1)和AOX2的基因序列(aox2)高度同源，但它们的启动子区域的DNA序列没有同源性。醇氧化酶启动子强度的差异是由醇氧化酶启动子上游转录调控序列控制，若将aox2置于PAOX1控制下，重组菌株具有AOX1相似的活力。相反，若将aox1置于PAOX2控制下，AOX1的表达量显著下降[6]。目前PAOX1因其调控严格，表达能力强等原因而被广泛研究[8-14]，但是依然没有明确其调控序列。而PAOX2的上游调控序列相关信息更少[15,16]。因此，突变PAOX2这样的弱启动子会比强启动子PAOX1更容易实现外源蛋白表达量的升高[17]。而且，研究PAOX2的上游调控序列较易得到相关调控序列，有利于阐明醇氧化酶启动子的调控序列。OHI 等[15]对毕赤酵母PAOX2上游调控序列进行敲除和插入序列，鉴定出PAOX2的一个上游激活序列(UAS)和两个上游抑制序列(URS)。……