唐昊，李沅秋，甘晓凤，罗朝兵

（乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614000）

竹子为多年生禾本科常绿植物，竹笋为竹子的嫩芽部分，除了富含蛋白质、糖类、维生素、氨基酸和膳食纤维等，还含有有机酸类、三萜类、酚类物质和大量的黄酮类物质，因此具有极高的食用价值及药理价值[1-3]。目前，关于竹笋营养成分的研究进展主要使用传统的生理生化方法，如陈松河等[2]比较了5种牡竹属笋用竹竹笋营养成分，发现牡竹属笋富含氨基酸、蛋白质和粗纤维。牛兆辉等[3]测定了小佛肚竹竹笋的营养成分，表明其主要成分组成为粗纤维、粗脂肪和蛋白质。此外，还发现龙竹竹笋富含蛋白质、总糖、粗脂肪、粗纤维和单宁等物质[4]。这些研究大多针对竹笋的几类营养物质，并未全面的了解竹笋的营养成分，因此利用代谢组学的方法对其营养价值进行全面研究是十分必要的。

代谢组学是通过气相色谱（gas chromatography，GC）、液相色谱（liquid chromatography，LC）与质谱（mass spectrometry，MS）联用等技术手段，采用组学分析方法，研究不同样本的所有代谢物，具有耗时短，准确度高，广覆盖的特点[5,6]。其中广泛靶向代谢组学是结合了非靶向代谢组学和靶向代谢组学的优点，基于广泛靶向代谢组数据库，采用多反应监测模式，定性、定量样本中代谢物检测方法[7,8]。因此，可利用广泛代谢组学对食品进行代谢产物的鉴定与分析，有助于全面了解食品的营养价值[9]。

慈竹（Bambusa emeiensis），禾本科慈竹属，地下茎合轴丛生型，低丘或平原地区的地理条件和环境极其适宜生长，尤其是四川、贵州和湖南等地区，是我国西南地区具有较广生长面积和较高经济价值的竹种[10]。慈竹笋颜色洁白，口感清脆，可被当作鲜菜、笋干及罐头等多类食品[11]。本研究应用气相色谱-质谱联用（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）手段，全面解析慈竹笋营养成分，同时从清除自由基、相对还原力、总抗氧化能力等方面系统研究其抗氧化活性，为促进慈竹笋的全面开发提供部分基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1 m高的慈竹笋采集于四川省乐山市中区竹林（东经103.77，北纬29.57）；甲醇、乙腈、甲酸铵、甲酸均购于Sigma公司；核糖醇、吡啶、BSTFA+TMCS、甲氧基胺盐酸盐均购于TCI公司。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000液相色谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Q Exactive Focus，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；7890A气相色谱仪，安捷伦科技(中国)有限公司；5975C质谱仪，安捷伦科技(中国)有限公司；53050真空浓缩仪，德国艾本德公司；SCIENTZ-48组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司；H1650-W冷冻离心机，德国艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及代谢物提取

2019年6月，采集1 m高的慈竹笋，分别收集竹笋基部、中部和顶部样本各5 g，混合后放置于50 mL冻存管，液氮速冻后放置于-80 ℃冰箱备用，剩余竹笋样本用于粗提物的提取。生物学重复9次。

取竹笋100 mg及5颗钢珠放入5 mL冻存管中，液氮速冻5 min，使用高通量组织研磨仪在70 Hz条件下研磨1 min。加入1400 μL预冷甲醇，涡旋振荡30 s（用于GC-MS检测样本需要加入60 μL 0.2 mg/mL核糖醇作为内标）。超声波室温处理30 min，加入750 μL氯仿和1400 μL预冷dd H2O，涡旋振荡1 min，然后14000 r/min冷冻离心10 min，取上清液1 mL并转移至1.5 mL离心管用于真空离心浓缩。

1.3.2 GC-MS

浓缩后的样本加入60 μL甲氧基溶液涡旋振荡30 s，37 ℃条件下反应2 h后加入60 μL BSTFA试剂（含1%三甲基氯硅烷），37 ℃条件下反应90 min。12000 r/min冷冻离心10 min，取上清液加入检测瓶中。从每个待测样本各取20 µL混合成QC样本（校正分析结果偏差及仪器自身造成失误），最后用待测样本进行GC-MS检测，共测9次。

采用HP-5MS毛细管柱（5%苯/95%甲基聚硅氧烷30 m×250 μm i.d.，0.25 μm film thickness，Agilent J& W Scientific，Folsom，CA，USA），以1 mL/min的恒流氦气来分离衍生化物质，1 µL样品以20:1分流比通过自动进样器注入。注射温度为280 ℃，接口设置为150 ℃，离子源调整到230 ℃。升温程序以60 ℃为初始温度，持续2 min，以10 ℃/min速率上升至300 ℃并停留5 min。质谱采用的是范围从35到750（m/z）的全扫描方法。

1.3.3 LC-MS/MS

用250 μL 2-氯苯丙氨酸（0.04 μg/g）甲醇水溶液（1:1，4 ℃）溶解浓缩样品，0.22 μm膜过滤，得到待测样本，进行LC-MS/MS上机检测。自每个待测样本各取20 µL混合成QC样本，用待测样本进行LC-MS/MS检测，共测9次。

色谱条件：T3色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 µm），调整自动进样器温度为8 ℃，柱温条件为40 ℃，以0.25 mL/min的速度进样2 µL，其中选择正离子0.1%甲酸水（D）-0.1%甲酸乙腈（C）和负离子5 mM甲酸铵水（B）-乙腈（A）作为流动相进行梯度洗脱，具体程序为：0~1 min，2% A/C；1~9 min，2%~50% A/C；9~12 min，50%~98% A/C；12~13.5 min，98% A/C；13.5~14 min，98%~2% A/C；14~20 min，2% C-正模式（14~17 min，2% A-负模式）。

质谱条件：质谱电离方式ESI，其中正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV。鞘气的流速30 arb，辅助气流速10 arb，毛细管温度325 ℃，70000的分辨率全扫描且范围是81~1000，HCD二级裂解，碰撞电压30 eV，选用动态排除将无关的MS/MS信息去除。

1.3.4 竹笋粗提物的制备

将采集的新鲜慈竹笋用蒸馏水冲洗3次，切成3 cm×3 cm小块，55 ℃烘干至含水量小于6%，将其粉碎后并过60目筛，得竹笋粉。称取竹笋粉3 g，加入120 mL 70%乙醇，35 ℃振荡萃取24 h，70 ℃水浴回流1.5 h，提取上清液。向剩余物中加入50%乙醇60 mL，70 ℃水浴回流1.5 h，提取上清液。将所剩残渣物4000 r/min离心10 min，提取上清液。将所有上清液合并，抽滤后经旋转蒸发至粘稠状，最后放人真空干燥箱中干燥。

1.3.5 抗氧化能力的测定

对慈竹笋粗提物的抗氧化物能力进行了测定，主要从清除DPPH自由基能力、清除羟自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力、相对还原力和总抗氧化能力五个方面进行。实验操作和武静文等在对毛竹、麻竹及雷竹的竹笋及笋壳提取物的实验方法一致[12-17]。

1.3.6 数据处理

采用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计分析，并用EXCEL绘图。

2 结果与分析

2.1 慈竹笋成分组成及分析

2.1.1 GC-MS

运用GC-MS平台共检测到75个代谢物，根据化学结构分为氨基酸、糖类、核苷酸、有机酸、脂肪酸、磷酸、胺类、多元醇以及其他等九大类（表1）。其中氨基酸数量最多，有24个代谢物，比例为32.00%，相对含量为7.72%；有机酸数量仅次于氨基酸，达到22个，占比为29.33%，相对含量为12.27%；相对含量最高的是糖类（74.30%），共有9个代谢物，占比为12.00%；其余代谢物相对含量较低，仅占总含量的5.71%。

表1 慈竹笋代谢物分类及相对含量Table 1 Metabolite classification and relative abundance of B.emeiensis shoot

进一步分析表明，相对含量在1%以上的代谢物有12种（表2）。相对含量在1%以上的代谢物有12种，其中相对含量最多的是糖类物质，包括葡萄糖（34.98%）、果糖（19.18%）、蔗糖（14.99%）、半乳糖（3.02%）和麦芽糖（1.04%）；有机酸3种：奎宁酸（7.14%）、苹果酸（2.46%）和莽草酸（1.54%）；氨基酸2种：天门冬氨酸（1.93%）和丝氨酸（1.64%）；磷酸1种：磷酸（3.98%）；多元醇1种：肌醇（1.05%）。

表2 慈竹笋GC-MS代谢组成分Table 2 Components of B. emeiensis shoot metabolome by GC-MS

2.1.2 LC-MS/MS

当通过LC-MS/MS共检测鉴定出226种代谢物，其中相对含量最高的是有机酸。由表3可知，占总量0.5%以上的代谢物共有16种，包括苯及取代并苯衍生物类3种：苯甲酸（31.44%）、对羟基苯甲醛（12.88%）和苯乙醛（0.89%）；羧酸1种：反式桂皮酸（0.71%）；嘌呤核苷类1种：肌苷（1.74%）；脂肪酰基类3种：甘油磷酸胆碱（1.14%）、胆碱（1.12%）和磷酸胆碱（0.66%）；氨基酸4种：L-谷氨酸（1.96%）、L-苯丙氨酸（0.63%）、肌酸酐（0.56%）和L-酪氨酸（0.55%）；糖类2种：阿洛酮糖（6.24%）和酮戊二酸（0.55%）；生物碱类1种：甜菜碱（21.28%）；未知类1种：植物鞘氨醇（2.24%）。

表3 慈竹笋LC-MS/MS代谢组成分Table 3 Components of B. emeiensis shoot metabolome by LC-MS/MS

2.1.3 成分分析

大量的研究表明，竹笋中含有丰富的糖类、有机酸、氨基酸和多肽类等物质[18-20]。在本研究中，GC-MS的结果显示，慈竹笋的代谢物种糖类的相对含量达到了74.30%。且有其他研究表明，如在Yushania alpina竹笋中，蔗糖、果糖和葡萄糖含量分别达到了0.58 g/100 g、0.62 g/100 g和0.77 g/100 g[21]。Wang等[22]的论述也表明竹笋因其含有的丰富糖类可以作为一种蔬菜为人类的生存提供能量和营养。另外，在GC-MS和LC-MS/MS的结果中，有机酸的相对含量都较高，其中含量最高的为苯甲酸，其次是甜菜碱和对羟基苯甲醛，相对含量均大于10%。苯甲酸在许多植物中参与了非生物因素的响应，如在大豆和番茄中能诱导植物对寒冷、干旱、和热产生耐受性[23]，与水胁迫协同作用可以进一步导致小麦幼苗生长高度变低[24]，苯甲酸还可以与肉桂酸协同作用解除氨基乙酰乙酸的抑花作用[25]，此外，苯甲酸常用于食品防腐剂，对腐败微生物具有良好的抑制作用[26]。甜菜碱具有良好的抗氧化作用[27,28]，具有降血脂的作用，而对羟基苯甲醛对由氧化应激导致血脑屏障具有保护作用[29]。这些结果表明慈竹笋是一种营养丰富的功能性食品原料，同时其含有的有机酸在竹笋的保鲜领域可能具有一定的潜在开发价值。通过这两种色谱方法，还鉴定出多种相对含量较高的氨基酸，如在本研究中发现的天冬氨酸和谷氨酸相对含量均较高（>1%），与五种牡竹属竹种中检测到的鲜味呈味氨基酸含量较高具有一定的一致性，表明慈竹笋中这两种氨基酸可能与慈竹的鲜味程度相关[2]；此外，天冬氨酸、丝氨酸及苯丙氨酸等在其他研究的代谢组中也被检测到[30,31]，其中对于苯丙氨酸而言，其在多种竹种中被认为与竹笋的苦味密切相关[2,30]，这些成分暗示了慈竹笋中的氨基酸在食品应用上，除了提供营养还可能影响慈竹笋的品尝感官。对于竹笋种含有的脂肪类物质，其含量都相对较少，在GC-MS结果中，脂肪酸类物质仅含0.17%，且在LC-MS/MS结果中，只有胆碱（1.12%）和甘油磷酸胆碱（1.14%）两种脂类物质相对含量大于1%，表明慈竹笋成分中脂类物质含量少。

2.2 慈竹笋提取物抗氧化分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力的测定

通过检测待测物质和DPPH反应后的吸光度，获得反应前后DPPH的浓度变化，可判断待测物质的清除DPPH自由基能力。如图1所示，慈竹笋提取物对DPPH自由基有较强的清除能力，且随着剂量的增加，DPPH自由基清除率相应增加，并成剂量依赖关系。当粗提物的浓度为0.1 mg/mL时，清除率为15.50%，Vc的清除率为78.10%；浓度为0.2 mg/mL时，清除率达到28.20%，Vc清除率为83.70%；浓度增加到1.0 mg/mL时，清除率达到82.70%，Vc为93.40%。武静文等的研究显示，当毛竹、麻竹及雷竹粗提物浓度在0.1 mg/mL~0.8 mg/mL之间时，随着浓度的增加，对自由基的清除作用增幅较大，而当粗提物浓度达到0.8 mg/mL时，增幅变缓[12]。此外，陈晓燕等的研究结果也表明当竹笋多糖含量对DPPH自由基的清除作用也随着多糖浓度的升高而增强，并在多糖浓度到1.0 mg/mL后趋近于平缓[32]。结合慈竹笋GC-MS代谢物分析结果中糖类物质的含量最为丰富，且经多种酶水解或裂解后产生大量的多糖，因此，我们推测可能是慈竹笋提物中含有的多糖对DPPH自由基的清除发挥了较强的作用。

图1 慈竹竹笋提取物对DPPH自由基的清除作用Fig.1 The elimination of DPPH· of extracts from B. emeiensis shoot

2.2.2 羟自由基清除能力的测定

羟自由基清除率的大小可反映慈竹竹笋的抗氧化能力。由图2所示，随着提取物浓度的升高，对羟自由基清除能力也随之增强，说明提物浓度与其羟自由基清除能力有一定量效关系。慈竹笋提取物羟自由基清除率较高，且高于Vc，表明其具有强的羟自由基清除抗氧化能力。当提物的浓度为0.1 mg/mL时，竹笋的羟自由基清除率为73.40%，Vc的清除率为68.80%，二者的清除能力均超过50%；而当提取物的浓度达到1.0 mg/mL时，竹笋的清除率为89.70%，Vc的清除率为84.10%，由此可见，慈竹笋提取物具有较高的羟自由基基础清除能力，且与毛竹春笋提取物在相应浓度对羟自由基的清除率接近[12]。

图2 慈竹竹笋提取物羟自由基清除能力Fig.2 The elimination of OH· of extracts from B. emeiensis shoot

2.2.3 超氧自由基清除能力的测定

如图3所示，随着竹笋提取物浓度的增加，超氧自由基清除能力呈上升趋势，表明浓度与其存在一定量效关系。竹笋提物清除超氧自由基能力明显弱于Vc，当竹笋粗提物浓度为1 mg/mL时，其清除能力仅有43.80%，而Vc清除能力达到89.50%。由此可见，慈竹笋提取物对超氧自由基清除能力介于麻竹笋和雷竹笋提取物之间，低于毛竹笋提取物；此外，毛竹笋、麻竹笋、雷竹笋提取物对超氧自由基清除能力显著弱于Vc[12]，表明竹笋具有较弱的超氧自由基清除能力。

图3 慈竹竹笋提取物超氧自由基清除能力Fig.3 The elimination of O2-·of extracts from B. emeiensis shoot

2.2.4 相对还原力的测定

样品相对还原力由Fe2+和Fe3+之间转移来表示，吸光值越高，还原力越强。如图4所示，随着提取物浓度的增加，相对还原力逐渐增强，说明提取物浓度与相对还原力呈一定量效关系。提取物相对还原力整体较弱，当浓度为0.1 mg/mL时，相对还原力仅为5.30%；当浓度达到1.0 mg/mL时，其相对还原能力也仅有27.90%。本研究显示慈竹笋提取物相对还原能力较弱，但与毛竹笋多糖提取物的相对还原力随多糖浓度增加，相对还原力缓慢增强的趋势相似[33]，此外，慈竹笋提取物相对还原力仍低于毛竹笋、麻竹笋和雷竹笋的笋壳提取物，当笋壳粗提物浓度达到1 mg/mL时，提取物相对还原能力均高于50%[12]，表明在相对还原力方面，笋壳比笋肉可能具有更好的表现。

图4 慈竹竹笋提取物相对还原力Fig.4 Reducing power of extracts from B. emeiensis shoot

2.2.5 总抗氧化能力的测定

如图5所示，竹笋提物总抗氧化能力明显弱于Vc。1 mg/mL的竹笋的吸光度平均值为0.43，FRAP值为100.10 μmol/L。而1 mg/mL的Vc的吸光度平均值为2.85，FRAP值为996.20 μmol/L。研究发现毛竹笋提取物FRAP值为353.80 μmol/L，麻竹笋和雷竹笋总抗氧化能力低于毛竹笋[12]。结果表明慈竹笋提物总抗氧化能力远高于毛竹笋、麻竹笋和雷竹笋，但仍低于Vc。

图5 慈竹竹笋提取物总抗氧化活性Fig.5 Total oxidation resistance of extracts from B. emeiensis shoot

3 结论

本研究运用GC-MS和LC-MS/MS广泛靶向代谢组学手段，对慈竹笋营养成分进行成分鉴定与分析，并从清除自由基、相对还原力、总抗氧化能力等方面系统研究了其抗氧化活性。通过GC-MS代谢组结果鉴定出75种代谢物，其中相对含量最高的三类物质依次为糖类（74.30%）、有机酸（12.27%）和氨基酸（7.72%），另通过LC-MS/MS鉴定出226种代谢物，其中苯甲酸、对羟基苯甲醛和苯乙醛等相对含量最高，代谢组鉴定结果说明慈竹笋包含有大量的糖类物质、多种的氨基酸和有机酸，可以用于营养慈竹笋，特定风味的慈竹笋食品的开发。此外，对慈竹笋提取物浓度达到1 mg/mL时，其抗氧化活性分析表明其对DPPH自由基清除率和羟自由基清除率较高，可达到80%以上，超氧自由基清除率为43.80%，但相对还原力较弱且FRAP值为同等浓度水平下Vc的1/10。综上，慈竹笋是一种营养丰富的功能性食品原料，对DPPH自由基清除和羟自由基的清除能力较强，因而本研究的结果可以为慈竹笋后期的食品加工利用提供一定的理论参考信息。