钟巧贤，袁淑英，梁秋燕，袁明贵，彭新宇，徐志宏，2，向 蓉,2*

(1.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东广州 510640；2.岭南现代农业科学与技术广东实验室肇庆分中心，广东肇庆 5262382)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)是人和动物肠道中最重要和最常见的微生物之一，属于人兽共患条件致病菌[1-2]。目前国际公认的分类主要有6个种类，其中肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)是能引起人和动物出血性腹泻和肠炎的一类大肠埃希氏菌，O157:H7血清型是其代表菌株。大肠埃希氏菌O157：H7 是目前世界公认的引起食源性疾病的重要致病菌和人兽共患病病原微生物，主要通过食物及饮食、肉及肉制品传播[3-5]。患病或带菌动物往往是动物来源食品污染的根源。猪是大肠埃希氏菌的重要宿主，在养殖过程中经常会面临细菌导致的感染。因此，大量抗菌药物在养殖临床使用，导致耐药菌的逐步形成。在屠宰过程中，猪胴体可能会被肠道中的耐药大肠埃希氏菌污染，耐药菌株通过感染生猪、污染猪肉再进一步通过食物链将其耐药性传播至人类，造成严重的食品安全和公共卫生问题[6]。因此，对屠宰场内大肠埃希氏菌O157：H7耐药性动态变化的监测也是一项极其重要的工作。本研究拟调查2018年-2019年从广东省内生猪屠宰场分离的19株大肠埃希氏菌O157:H7耐药情况，以期了解对其敏感的药物，为有效控制大肠埃希氏菌O157:H7的感染提供科学依据，保障公共卫生安全。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 2018年-2019年从广东省内生猪屠宰场屠宰过程中的猪肉、肝脏和脾脏等856份样本中分离鉴定的19株大肠埃希氏菌O157:H7和标准菌株大肠埃希菌ATCC 25922，均由广东省农业科学院动物卫生研究所兽药研究室保存。

1.1.2 主要试剂和药物 营养肉汤、MH肉汤、麦康凯琼脂培养基、2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000、GeneRed核酸染料、琼脂糖、甘油，均为广州顺锋生物科技有限公司产品。

青霉素，北京鼎国昌盛生物科技有限公司产品；阿莫西林，大连美仑生物技术有限公司产品；红霉素，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司产品；氨苄西林、硫酸卡那霉素、氟苯尼考、多西环素、磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星、多黏菌素B硫酸盐、硫酸庆大霉素、头孢氨苄、头孢哌酮、链霉素、氯霉素、利福平等13种抗菌类药物，均为广州顺锋生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 单道可调量程移液器(Research plus 0.5 μL～10 μL，10 μL～100 μL )，德国Eppendorf公司产品；恒温恒湿培养箱(HWS-158L)，广州市深华生物技术有限公司产品；台式全温振荡器(THZ-C-1)，苏州培英实验设备有限公司产品；PCR扩增仪(Mastercycler X50S)，德国Eppendorf公司产品；核酸电泳仪(PowerPacTM Basic)，美国Bio-Rad公司产品；凝胶成像分析系统(ZF-258)，上海嘉鹏科技有限公司产品；96孔细胞培养板(Corning/Costar 3599)，广州顺锋生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 以大肠埃希氏菌ATCC25922作为质控菌株，MH肉汤作为培养基，在96孔细胞培养板中采用微量肉汤稀释法对19株大肠埃希氏菌O157:H7进行16种兽医临床常用抗菌药物的药敏试验，所有操作和标准严格按照2015 版CLSI 标准执行。

1.2.2 DNA模板提取 水煮法提取细菌DNA模板，振荡过夜培养的菌液3 mL经10 000 r/min离心5 min收集菌体沉淀，沉淀重悬于无菌蒸馏水后煮沸10 min，迅速转冰浴5 min，再经10 000 r/min离心5 min，取上清即为模板DNA，置-20℃保存备用。

1.2.3 引物设计及合成 参考文献[7-12]针对大肠埃希氏菌的β-内酰胺酶基因blaNDM-1、blaTEM，多黏菌素mcr-1 基因，四环素类耐药基因tetA、tetB、tetM，氯霉素类抗药基因floR，氨基糖苷类耐药基因aac(3)-Ⅱa、aph(3’)-Ⅶ、rmtB等10种耐药基因合成引物，引物序列见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 耐药基因引物序列

1.2.4 PCR反应程序 预变性：95℃，5 min；变性：95℃ ，40 s；退火条件分别为：60℃(blaNDM-1)，40 s；59.8℃(mcr-1)，40 s；56℃(blaTEM)，40 s；54℃(rmtB)，30 s；62℃(tetA)，30 s；62℃(tetB)，30 s；55℃(tetM)，1 min；68.5℃(floR)，1 min；54.5℃(aac(3)-Ⅱa)，30 s；56.5℃(aph(3′)-Ⅶ)，30 s；延伸条件:72℃，2 min；30个循环。总延伸条件：72℃，5 min。

1.2.5 耐药基因检测 利用PCR对19株菌株进行耐药基因检测。PCR反应体系：DNA模板2 μL，上、下游引物各2 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，无菌去离子水补足至50 μL。取5 μL PCR产物，用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收目的条带后与pMD18-T载体连接，转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选出疑似阳性菌落提取质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。

2 结果

2.1 药敏试验结果

19株大肠埃希氏菌O157:H7药敏试验结果表明，菌株对16种抗菌药物存在耐药差异。其中，对阿莫西林、氨苄西林、青霉素、氯霉素和恩诺沙星耐药率最高，全部达到100%，其次对多黏菌素B(84.21%)、头孢氨苄(78.95%)、红霉素(78.95%)都在80%左右，耐药率最低的是头孢哌酮(5.26%)，其他也均在31.58%～73.68%之间(表2)。所有菌株都呈现不同程度的多重耐药，耐7种受试药物的菌株有1株，耐8种的有4株，耐9种的有1株，耐11、12种的各有3株，耐13种的有1株，耐14种、15种的各有3株(见图1)。药敏实验结果说明该地区屠宰场猪源大肠埃希氏菌O157:H7对多种药物产生耐药性，耐药及多重耐药情况严重。

表2 19株大肠埃希氏菌O157:H7耐药性情况

图1 19株大肠埃希氏菌O157:H7多重耐药情况

2.2 耐药基因检测结果

以提取的19株大肠埃希氏菌O157:H7的DNA为模板，采用PCR检测10种耐药基因。结果显示，mcr-1、tetM、floR、rmtB4种耐药基因未检出，其他6种耐药基因PCR均扩增出了与预期大小一致的条带；其中检出率最高的是tetA耐药基因，检出率为89.47%，检出率较低的是blaNDM-1耐药基因，检出率为5.26%，其余耐药基因检出率分别在31.58%～73.68%之间，表明屠宰场分离的大肠埃希氏菌O157:H7携带不同的耐药基因，详见表3。

表3 19株大肠埃希氏菌O157:H7分离株耐药基因的检测

2.3 耐药表型和耐药基因的分布

19株大肠埃希氏菌O157:H7的耐药谱和耐药基因分布见表4。除了头孢哌酮之外，β-内酰胺类抗生素的耐药率和β-内酰胺酶的检出率均为最高，说明本次屠宰场分离的大肠埃希氏菌O157:H7对β-内酰胺类中的青霉素类和第一代头孢类药物耐药严重，而产β-内酰胺酶是导致耐药的重要原因，头孢哌酮属于第三代头孢类抗生素，目前对大肠埃希菌还有较好的抗菌效果，所以本次试验结果头孢哌酮的敏感率最高。四环素类耐药基因检出率也很高，但菌株对本次试验受试药物多西环素的耐药率在50%以下，可能与受试四环素类药物较少有关。氨基糖苷类药物耐药率及氨基糖苷类钝化酶检出率也相应较高。氟苯尼考耐药率68.42%，但未检出floR基因，可能存在其它耐药机制，如靶位结构改变或细胞膜的通透性改变等。多黏菌素B耐药率84.21%，但mcr-1基因也未检出，耐药可能由产荚膜多糖或外排泵系统等其它机制引起。由表可知，同一株菌中耐药表型和耐药基因有一定的关系也存在不一致性，这也体现了耐药机制的复杂性。

表4 耐药谱和耐药基因分布情况

3 讨论

本研究选择β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类、大环内酯类、氟喹诺酮类、磺胺类、多肽类和利福霉素类等9大类16种抗菌药物进行耐药分析，这几类抗菌药物在临床均常见使用。大肠埃希氏菌O157:H7对阿莫西林、氨苄西林、青霉素、氯霉素和恩诺沙星的耐药率最高，均为100%，其次为多黏菌素B、头孢氨苄、红霉素、磺胺间甲氧嘧啶、氟苯尼考、卡那霉素、链霉素、利福平，都在50%以上，耐药率较低的是多西环素(42.11%)和庆大霉素(31.58%)，个别菌对头孢哌酮耐药(5.26%)，这3类药物可为临床治疗提供参考。所有菌株都呈现出多重耐药，耐药数最多的1株对16种受试药物中15种不敏感。薛力刚等[13]从仔猪粪便中分离的大肠埃希氏菌O157:H7对16 种药物药敏试验结果显示，分离株对磷霉素和丁胺卡那霉素的敏感性高；其次是头孢噻肟、诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、呋喃妥因；对红霉素、青霉素G、氨苄西林、利福平的耐药性高，与本研究结果有相似性。李军等[14]发现广西猪源大肠埃希氏菌O157:H7只对氟苯尼考、头孢曲松、头孢西丁和头孢噻肟敏感；对罗红霉素、多黏菌素B、利福平、林可霉素、阿莫西林、氨苄西林和头孢噻吩的耐药率为100%；对壮观霉素、链霉素、头孢拉定等药物的耐药率在20%～60%之间，调查菌株均为多重耐药，耐药最多的1株对27种受试药物中的23种不敏感。不同时间、不同地区的大肠埃希氏菌O157:H7呈现出不同的耐药特点，这也能反应出不同地方兽医临床用药的特点，但多重耐药严重已是普遍现象。

tetA和tetB基因编码外排机制是来源于人类和动物大肠埃希氏菌中最常见的四环素耐药决定因素，有些分离株以tetA基因为主导地位，而另一些研究发现tetB基因占主导地位[15-16]。本研究中19株细菌有17株携带tetA基因，而其中6株菌同时携带tetB基因，说明tetA基因是本次分离细菌中四环素耐药的主导基因。blaTEM型是产超广谱β-内酰胺酶菌株最常见的基因型，可通过染色体介导也可通过质粒介导，90%青霉素抗性大肠埃希氏菌都具有blaTEM基因型[15]。本次研究中blaTEM基因携带率仅次tetA，有14株细菌检出，而青霉素耐药也达到100%。氨基糖苷类钝化酶基因检出率也较高，李军等[14]调查广西猪源大肠埃希氏菌O157:H7时也发现普遍携带氨基糖苷类钝化酶基因，说明氨基糖苷类耐药基因也是普遍存在。耐药基因是导致细菌耐药表型的重要机制，但耐药表型和耐药基因型之间没有完全的一致性。所以本研究中耐药表型和耐药基因之间也存在着复杂的关系。

微生物与食品的卫生质量有着密切的联系，在食品的生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有造成污染的可能。大肠埃希氏菌O157:H7作为食源性致病微生物污染食品后，可能大量繁殖而引起食品腐败变质，或产生毒素，从而导致食源性疾患，危及人体健康[17-18]。屠宰场是肉制品加工的源头环节，也是微生物污染的重要环节，对公共卫生影响十分重要。本次研究的大肠埃希氏菌O157:H7均从屠宰场屠宰过程中的猪肉、肝脏和脾脏中分离出来，结果说明屠宰场污染的大肠埃希氏菌O157:H7耐药性严重，也体现猪业养殖过程中抗菌药物的滥用情况。鉴于本研究结果，亟需加强大肠埃希氏菌O157:H7的动态监测，有效遏制其耐药性发展，保障猪肉及猪肉制品的安全，进而保障消费者健康。