郭远治，边小利，陈胡羚，王虹雅，李引乾*

(1.西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨陵 712100；2.略阳县六畜兴旺养殖有限责任公司，陕西略阳 724300；3.府谷县动物疫病预防控制中心，陕西府谷 719400 )

七清败毒散是由生石膏、金银花、鱼腥草、板蓝根、忍冬藤、贯众、甘草等中药制成的一种中药复方散剂，具有清热解毒，清温凉血，败毒燥湿等功效。主要用于治疗畜禽类温毒、湿毒、疫疠等病毒性传染疾病。随着我国畜牧业的蓬勃发展，养殖业的集中规模化，畜产品中兽药残留问题成为了人们关注的焦点。而中兽药因其天然性、多能性、毒副作用低、不易产生有害物质残留和耐药性等优点被兽医临床广泛应用[1-3]。中兽药散剂又因其制作简便、价格低廉、使用方便等优势而备受青睐[4-5]。

目前，兽药领域有许多中兽药散剂的研究。Huang X等[6]研究证明以传统中兽药为基础的中药散剂能通过药物治疗保留胎盘来提高荷斯坦奶牛的生育能力；Yu B等[7]对“石苦秦”散剂从急性和亚慢性毒性及安全性药理学等方面进行了研究。

本研究主要采用紫外分光光度法测定七清败毒散中主药金银花的主要成分绿原酸的含量[8-9]，并用薄层色谱法对散剂中的主药板蓝根进行鉴别[10]。从性状、含量测定及鉴别等多方面研究了七清败毒散的质量标准，为指导该散剂的生产、检验及储存具有重要意义[11]。保证该制剂能发挥有效疗效的同时，更要保证该制剂的安全性、稳定性，减轻畜禽患病以提高畜禽产品安全性及质量，有利于我国畜禽养殖业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品及试剂 七清败毒散(1 000 g/袋，批号：20180602)、七清败毒散金银花阴性对照品、七清败毒散板蓝根阴性对照品，内蒙古润龙生物科技有限公司产品；绿原酸对照品(批号：110753-201814)、精氨酸对照品(批号：110872-201806)，天津市富宇精细化工有限公司产品；GF254薄层专用硅胶(批号：181012)，青岛海洋化工有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 紫外分光光度计(SPECORD 50)，德国耶拿(Jena)分析仪器股份公司产品；电子分析天平(BS-210S)，德国赛多利斯(Sartorius)股份公司产品；漩涡振荡器(QL-901)，其林贝尔仪器制造公司产品；超声波清洗器(KQ5200)，昆山市超声仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 板蓝根薄层色谱鉴别 取七清败毒散样品10 g，加稀乙醇30 mL，超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至黏稠状，加入乙醇50 mL，搅拌，超声处理30 min，静置，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇1 mL，使其溶解，作为供试品溶液。另取精氨酸对照品，加稀乙醇制成浓度为0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

薄层色谱法(药典附录ⅥB)试验：吸取供试品溶液10 μL和对照品溶液2 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(自然干燥)，以正丁醇-冰醋酸-水(19∶5∶5)为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上应显相同颜色的斑点。结果3批供试品的色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，斑点不清晰，分离不彻底。参考盐酸精氨酸的国家质量标准，将展开剂改为乙醇-浓氨溶液(70∶30)。吸取供试品溶液10 μL和对照品溶液2 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(自然干燥)，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰；另取不含板蓝根的阴性对照药品10 g，同法试验。

1.2.2 绿原酸含量测定

1.2.2.1 吸收波长的选择

(1)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品6.60 mg置于10 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶液溶解定容至刻度作为总储备液。取总储备液2.5 mL于25 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶液定容制得储备液。分别精密量取储备液2 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL、4 mL于25 mL容量瓶用50%的甲醇溶液定容，即为标准对照品溶液。

(2)光谱扫描：取标准品溶液适量，在200 nm～500 nm波长范围内进行光谱扫描。

1.2.2.2 线性关系考察 取上述不同浓度的标准对照品溶液，摇匀后在322 nm处测定吸光度。

1.2.2.3回收率和精密度试验 取已知含量的供试品，精密称定，再加入一定量的绿原酸对照品，按供试液的制备方法同法制备，制成相当于绿原酸浓度分别为11.25 μg/mL、14.03 μg/mL、16.00 μg/mL的样品。按照添量法在322 nm处测定吸光度，计算回收率。

将同样3个浓度的样品，在1天内3次重复测定，求出批内变异系数，并于1周内隔天测定3次，求出批间变异系数。

1.2.2.4 含量测定 取本品于研钵中研细，精密称取2.0 g，置25 mL容量瓶中，加50%的甲醇溶液20 mL，超声处理30 min，冷至室温，50%的甲醇溶液加至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液10 mL，用50%的甲醇溶液定容至10 mL，摇匀，即为供试液，同一批次共制备8份供试品溶液，在322 nm处测定吸光度。

2 结果

2.1 板蓝根薄层色谱鉴定

七清败毒散中对板蓝根的薄层色谱鉴定结果如图1。

1、3.精氨酸对照；2.阴性对照；4.样品1、3.Arginine contrast; 2.Negative contrast; 4.Sample

根据图1得出结果，供试样品的色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点；在阴性对照色谱中，在相应位置上没有斑点，说明阴性无干扰。

2.2 绿原酸含量测定

2.2.1 光谱扫描结果 绿原酸对照品在200 nm～500 nm波长之间的扫描图谱如图2。

图2 绿原酸扫描图谱

绿原酸在322 nm处的有最大吸光度0.222 3，确定其最大吸收波长为322 nm。

2.2.2 线性关系考察 以不同浓度的标准对照液吸光度(A)为纵坐标，以浓度(C)(μg/mL)为横坐标，绘制绿原酸标准曲线，如图3。

图3 绿原酸标准曲线

得直线回归方程：A=0.037 3×C-0.009 9(r=0.999 9，n=6)。结果表明，绿原酸在13.2～66.0 μg/mL范围内具有良好的线性关系(图3)。

2.2.3 回收率和精密度试验 回收率试验结果见表1，精密度试验结果见表2。

绿原酸的平均回收率为98.77%，回收率范围在70%～110%之间，日间和日内平均精密度分别为0.356%和0.096%，均小于5%。显示该方法可靠，无需进行浓度校正。

2.2.4 含量测定 含量测定结果见表3。

表3 七清败毒散绿原酸含量测定结果

有上表可知，该批次七清败毒散的绿原酸的平均含量为1.763 μg/mg。

3 讨论

3.1 板蓝根的薄层鉴定

参照《兽药典》(二部)中药质量标准制备供试液[12]，板蓝根取本品粉末10 g，加稀乙醇30 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇1 mL，使其溶解，作为供试品溶液。结果显示供试品溶液黏度过高，无法点样。根据精氨酸在乙醇中的微溶性，将提取方法修改如下：取本品粉末10 g，加稀乙醇30 mL，超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至黏稠状，加入乙醇50 mL，搅拌，超声处理30 min，静置，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇1 mL，使其溶解，作为供试品溶液。参照药典附录ⅥB进行薄层色谱分析试验：吸取供试品溶液10 μL和对照品溶液2 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(自然干燥)，以正丁醇-冰醋酸-水(19∶5∶5)为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果显示，供试品的色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，斑点不清晰，分离不彻底。因此，本研究参考盐酸精氨酸的国家质量标准，将展开剂改为乙醇-浓氨溶液(70∶30)。

3.2 绿原酸含量的测定

绿原酸为酚酸类成分，具有良好的水溶性。但由于绿原酸分子结构中含有酯键、不饱和键及多元酚，绿原酸水溶液易发生水解和氧化反应，虽然在制备供试溶液时使用的是 50%甲醇溶液，但也应该将样品溶液贮存在避光低温的环境中，试验过程中应尽量避光操作，最好选择棕色的容器。李红英[8]等对比了高效液相色谱法和紫外分光光度法对金银花中绿原酸质量分数分析的结果，得出紫外分光光度法测定金银花中绿原酸含量的方法简便、易操作，且测定结果较准确，适用性强。因此，本研究选用紫外分光光度法，研究结果也表明该方法可用于七清败毒散的质量控制。