孙海红 薛鲁燕 孙永红 张瑞巧 王文娇 蔡葵 赵征宇

摘要 莼菜多糖具有抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种生理活性。从莼菜（Brasenia schreberi）中提取胶质多糖，采用碱提和酶法预处理提取莼菜多糖，经过除蛋白、醇沉、透析得到多糖组分，并结合高效液相色谱（HPLC）、原子力显微镜（AFM）和扫描电镜（SEM）等现代仪器技术和物理化学方法对其进行单糖组分、纯度及分子量测定等分析。莼菜多糖的提取工艺为料液比1∶20（W/V），纤维素酶100 U/g、果胶酶100 U/g 、木瓜蛋白酶1 100 U/g，pH为5，预处理温度为50 ℃，时间3 h。再用0.02 mol/L NaOH溶液30 ℃加热3 h提取，得率为0315%。高效液相色谱法测得的莼菜多糖中单糖组成分为鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖，摩尔比约为1.0∶1.0∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0，凝胶渗透色谱测得分子量2.44×106。部分酸水解后单糖组成表明莼菜多糖的中心链主要为葡萄糖醛酸和半乳糖，支链的边缘结构或末端残基结构为鼠李糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖和木糖。通过原子力显微镜和扫描电镜观察可知莼菜多糖是呈网状交联的凝胶结构。

关键词 莼菜;多糖;理化性质;空间结构

中图分类号 S645.9文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）02-0158-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.043

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Extraction and Physicochemical Properties of Polysaccharide from Brassica schreberi

SUN Haihong， XUE Luyan， SUN Yonghong et al

（Qingdao Academy of Agricultural Sciences， Qingdao， Shandong 266100）

Abstract Polysaccharide from Brassica schreberi had antitumor， hypoglycemic， hypolipidemic and other physiological activities. In this paper， the extraction conditions of glycine from Brasenia schreberi were optimized. The physicochemical properties and spatial structure of the glycine were studied. The optimized extraction process was as follows： the ratio of material to liquid 1∶20 （W/V）， cellulase 100 U/g， pectinase 100 U/g， papain 1 100 U/g， pH 5， the pretreatment temperature 50 ℃， time 3 h. And then the product treated with 0.02 mol/L NaOH solution at 30 ℃ for 3 h.The yield of glycine was 0.315%. The monosaccharides was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. The glycine was composed of rhamnose， glucuronic acid， galactose， xylose， arabinose and fucose at the ratio of 1.0∶10∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0. It had a molecular weight of 2.44×106. Partial acid hydrolysis revealed that the central chain of polysaccharide was mainly composed of glucuronic acid and galactose. Rhamnose， galactose， fucose， arabinose and xylose consisted the branches of the polysaccharide. Atomic force microscopy and scanning electron microscope showed that B. schreberi polysaccharides formed a chain structure with branch nodes. The chain structure crosslinked to form a network of fibrous structures.

Key words Brasenia schreberi;Polysaccharide;Physicochemical properties;Spatial structure

莼菜（Brasenia schreberi J.F.Gmel）系原始花被亞纲睡莲科（Nymphaeaceae）植物[1]，属多年生淡水水生草本植物，又名马蹄草、湖菜、水葵、露葵，生长于池塘、湖泊和沼泽中[2-3]。近年来，由于其在食用和药用上的突出价值，因而受到人们的普遍关注[4]，我国很早就将莼菜作为药食两用。作为食物，其鲜嫩滑腻，用来调羹作汤，清香浓郁，被视为宴席上的珍贵食品。据《本草纲目》记载[5]，莼菜具有消渴热痹、治热疸、厚肠胃、安下焦、逐水、解百药毒等功效。现代医学认为其有调节免疫功能、抗肿瘤、抗感染、降血糖、降血脂、延年益寿的功效[6-9]。目前，国内对莼菜多糖的研究主要集中在对莼菜的深加工研究和莼菜多糖的提取工艺优化方面，这为研制具有营养保健作用的莼菜多糖饮料奠定了基础。但是，由于莼菜多糖黏度大，难以纯化，国内现有的大部分研究都停留在多糖粗提物的提取和生理功能方面，而对莼菜多糖的分离纯化和结构分析非常少，没有给莼菜体外胶质活性多糖的分离纯化及其生理生化功能的研究打下好的基础。多糖分离纯化手段的进步和现代仪器测试技术的迅速发展，尤其是原子力显微镜（AFM）和核磁共振（NMR）技术在多糖领域的应用，促进了多糖结构的深入研究。在莼

菜多糖活性和提取工藝研究的基础上，结合现代色谱分离技术对莼菜胶质多糖的理化性质、结构、主链和支链具体连接方式以及构型和空间结构等问题进行研究，对莼菜多糖的后续开发意义重大。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

莼菜购自浙江杭州;甘露糖（Man）、氨基葡萄糖（GlcN）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（GaD）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）和岩藻糖（Fuc）标准品及胎牛血清白蛋白标准品为美国Sigma公司产品;高聚葡聚糖分子量标准品（P82）以及Shodex Ohpak SB-804HQ（8.0 mm×300 mm）凝胶色谱柱为日本Shodex公司产品;其他试剂均为国产分析纯。高效液相色谱仪（LC-20AD，日本岛津公司）、紫外检测器（SPD-20A Shimadzu公司）、紫外可见分光光度计。

1.2 莼菜多糖的提取[10-11]

采用酶预处理结合碱液提取：取醋酸浸渍过的莼菜，按料液比1∶20（W/V）加入蒸馏水，加入纤维素酶100 U/g、果胶酶100 U/g、木瓜蛋白酶1 100 U/g，调节pH为5，预处理温度为50 ℃，浸渍3 h后灭酶。再用0.02 mol/L NaOH溶液提取莼菜多糖，置于热电恒温水浴锅中，30 ℃加热3 h，残渣按上述提取方法再重新提取1次，趁热离心（4 000 r/min，15 min），合并2次提取的上清液，调节pH至中性，浓缩提取液至原体积的1/10。

在提取莼菜多糖过程中，同时会提取出大量蛋白质、无机盐、小分子有机物（氨基酸和低聚物等）以及色素等。采用Sevage法脱蛋白：1/3氯仿-正丁醇（体积比为4∶1），与浓缩后的多糖提取液混合，在常温下经磁力搅拌30 min，离心，使蛋白质变性再除去有机相，变性后的蛋白质呈胶状，重复上述操作，直至无游离蛋白为止。

将脱完蛋白的莼菜多糖样品用4倍体积的预冷95%乙醇溶液沉淀，搅拌均匀，放入4 ℃冰箱中静置过夜。

乙醇沉淀莼菜多糖，离心（4 000 r/min，15 min），弃上清液，取沉淀溶解，放入透析袋中（截留分子量3 500透析袋）透析48 h，透析过程中每隔4 h换一次水。取透析后的莼菜提取液浓缩（原体积的1/20～1/10，45 ℃），冷冻干燥得到莼菜多糖样品，粗品为黄褐色絮状物。

粗多糖得率=粗多糖的质量/新鲜莼菜的质量×100%

1.3 莼菜多糖的单糖组成分析[12]

多糖的完全酸水解：准确称取10 mg莼菜多糖样品，在安瓿瓶中加入2 mL 2 mol/L 的三氟乙酸（TFA），封管后再置于110 ℃烘箱内进行水解反应8 h。多次反复加入甲醇蒸干除去溶液中的三氟乙酸，烘干。单糖标准溶液的制备：准确称取等量干燥的单糖标准品，加入蒸馏水配制成1.0 mg/mL溶液。

采用PMP柱前衍生高效液相色谱法对莼菜多糖完全水解后的产物和单糖标准品进行衍生和高效液相色谱分析。色谱条件：色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH =6.7），乙腈（CH3CN 82∶18，V/V），流速1 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL;检测器：UV 254 nm。

1.4 莼菜多糖的部分酸水解[13]

取多糖样品10 mg于安瓿瓶中，加入4 mL 0.01 mol/L的TFA，密封后105 ℃水解1 h，水解样品除去TFA并浓缩后加4倍体积无水乙醇沉淀多糖，于4 ℃冰箱静置、离心，上清1浓缩、烘干;所得沉淀部分烘干后，加入4 mL 0.05 mol/L的TFA，105 ℃水解1 h，水解样品加4倍体积乙醇沉淀多糖，静置、离心，上清2浓缩、烘干;所得沉淀烘干，继续加入4 mL 0.1 mol/L的TFA，105 ℃水解1 h，水解样品加4倍体积乙醇沉淀多糖，静置、离心，上清3浓缩、烘干，沉淀烘干。

1.5 莼菜多糖的分子量测定

采用高效凝胶渗透色谱法[14]测定莼菜多糖分子量，此方法测定分子量的范围很宽。用流动相将莼菜多糖配制成6 mg/mL的溶液，离心并吸取上清液，置于4 ℃冰箱备用。试验条件：凝胶色谱柱（8.0 mm×300 mm），柱温35 ℃，流速0.5 mL/min，流动相为01 mol/L的Na2SO4溶液。

标准曲线的制作：将已知分子量的系列标准葡聚糖用01 mol/L的Na2SO4 溶解，制得标准溶液的浓度为5 mg/mL。用保留时间（tR）作为横坐标，标准多糖分子量的对数（logMw）作为纵坐标，利用GPC分析软件作图，绘制标准曲线。

1.6 莼菜多糖的空间结构观察[15]

原子力显微镜观察：用去离子水配制质量浓度为10 μg/mL 的样品溶液并冷却至室温，取适量样品滴于新鲜剥离的云母片表面，在干燥器中室温干燥过夜，取准备好的云母片进行原子力显微镜（横向分辨率为0.1 nm，垂直分辨率为0.01 nm）观察。

扫描电镜：最大放大倍数100 万倍，分辨率0.14 nm，加速电压120 kV。先将配制好的 样品溶液进行超声分散（超声5 min），然后将其滴于有支撑膜的铜网上，常温下放至干燥后进行观察。

2 结果与分析

2.1 莼菜多糖的提取

莼菜胶质多糖属于黏液细胞分泌的酸性杂多糖，采用醋泡的方法可以减少其在水中的溶出，维持其凝胶状态。纤维素酶、果胶酶及蛋白酶处理，可以破坏莼菜细胞细胞壁，促进莼菜胶质多糖的溶出，并减少蛋白及果胶类杂质，提高多糖的纯度。通过碱提可以使酸性多糖离子化，增加提取率。碱类溶剂提取莼菜多糖的效果比普通的热水提取效果好，但是高浓度的碱溶液会使蛋白质、果胶和可溶性色素等物质大量溶出[10]，最佳浓度为0015 mol/L，碱浸提取温度过高会使所得的莼菜多糖颜色加深，故30 ℃为最佳提取温度。酶提加碱提可以最大限度促进莼菜胶质多糖的释放。提取液浓缩为原体积的1/20，脱蛋白后4倍体积乙醇沉淀，透析后冻干，湿重得率约为035%。

2.2 莼菜多糖的單糖组成

PMP柱前衍生单糖组成分析表明（图1、2），莼菜多糖中单糖组成主要有半乳糖，另外还有少量的鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖。鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖按照其相对峰面积比可得单糖组分的摩尔比约为1.0∶1.0∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0。从糖组成比例来看，莼菜多糖以半乳糖组成比例最高。结果与之前报道的莼菜多糖的大致相同，但是单糖的组成比例略有不同。由于莼菜的营养物质受到生长环境和采摘期时间的影响，各文献报道的组分比也各不相同[16]。

2.3 莼菜多糖的部分酸水解

部分酸水解的原理是利用多糖链中支链糖苷键易水解脱落，而构成糖链的中心链结构部分相对稳定，因此了解多糖结构、单糖组成分布常采用部分酸水解法处理。多糖经过部分酸水解后醇沉、离心，将上清液和沉淀分别进行测量可以得到许多组分片段，从这些小片段的单糖组成可以推测多糖链的单糖分布。由结果可知，在弱酸的条件下，首先被降解下来的是鼠李糖、半乳糖、木糖、岩藻糖和阿拉伯糖。特别是鼠李糖、岩藻糖和阿拉伯糖在上清1中含量最高，说明这3种糖最容易被降解下来，并位于莼菜多糖的外围支链中。在上清2中，木糖增多，鼠李糖、岩藻糖和阿拉伯糖减少，说明木糖位于支链内侧或者靠近主链的位置。4个组分中半乳糖一直存在，表明半乳糖既存在于支链，又存在于主链。葡萄糖醛酸只在上清3和沉淀中存在，表明葡萄糖醛酸很有可能存在于主链中。

2.4 莼菜多糖的分子量

对莼菜多糖进行凝胶渗透色谱分析，图中样品峰呈单一对称峰，表明莼菜多糖纯度较高，为单一组分，但是样品峰跨度较大，可能是由于样品黏度较大。根据已知分子量标准品的标准曲线计算后得莼菜多糖分子量为2.44×106。由此可知，莼菜多糖属于天然的高分子量多糖。

通过部分酸水解结果可知，莼菜多糖的主链主要由葡萄糖醛酸和半乳糖组成，支链主要由鼠李糖、半乳糖、木糖、岩藻糖和阿拉伯糖组成，鼠李糖、岩藻糖和阿拉伯糖位于支链的最外侧[17]（表1）。

安徽农业科学2021年

2.5 莼菜多糖的空间结构

图3为莼菜多糖水溶液的原子力显微镜扫描图，可见莼菜多糖在云母片上呈环形网链状结构，且是由大分子链相互连接而成。每个环状结构上可以清楚地看到侧支链结构，一般情况下多糖的分子链大小为0.1～1.0 nm，该多糖聚合物分子间互相缠绕，链之间通过不同糖单元连接成大大小小的环或者分支侧链，证明了多糖大分子是具有高度分支的化学结构。扫描电镜也显示莼菜多糖具有疏松多孔的交联结构（图4）。由此可见，莼菜多糖在水溶液中可以形成疏松多孔的凝胶状结构[18]。

3 结论

通过酶提联合碱提的方法确定莼菜多糖的最佳提取工艺为料液比1∶20（W/V），纤维素酶100 U/g、果胶酶100 U/g、木瓜蛋白酶1 100 U/g，pH为5，预处理温度为50 ℃，时间3 h。再用0.015 mol/L NaOH溶液30 ℃加热3 h提取，得率为0.315%，纯化分离可得分子量大小为2.44×106。高效液相色谱法测得的莼菜多糖中单糖组成分为鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖，按照其相对峰面积比可得单糖组分的摩尔比约为1.0∶1.0∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0。该糖的中心链主要为葡萄糖醛酸和半乳糖，支链的边缘结构或末端残基结构为鼠李糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖，木糖则靠近主链的位置。原子力显微镜和扫描电镜可观察到莼菜多糖分子以聚合体状态呈环形网链状结构并形成凝胶，所以莼菜多糖作为富含半乳糖的酸性杂多糖具有独特的理化性质和凝胶特性。该研究为莼菜多糖进一步的开发利用提供了重要参考价值。

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