黄润英,范智利,肖吉群,郑 巍,蔡 强

(宜宾市第二人民医院儿科, 四川宜宾 644000)

病理性新生血管增生造成的早产儿眼部疾病,已成为当今发展中国家和发达国家儿童失明的主要原因, 氧诱导视网膜病变( oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠模型是目前与新生血管增生较为类似模型,且最常见[1];及早治疗可有效改善视功能, 目前抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)治疗已具有满意效果[2],合适的抗VEGF 是治疗的关键。 多种促血管微小RNA(microRNA, miRNA)和抗血管miRNA 共同调控血管新生,引起 VEGF 异常表达[3]。 miR-20a-5p 是miR-17-92 家族成员之一,抑制 miR-17、miR-20 可增加血管生成[4],miR-20a-5p 表达水平影响炎症反应、细胞增殖、细胞凋亡、组织修复、细胞外基质重塑、血管新生以及恶性病变等多种病理机制[5],且在第37 届圣安东尼奥乳腺癌研讨会上已作为抗VEGF 因子用于治疗乳腺癌[6],但是否可用于OIR 治疗尚不清楚。 因此,建立 OIR 模型,观察miR-20a-5p 对OIR 小鼠的影响并初步探讨其机制,为OIR 靶向治疗提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康无特定病原体动物(specific pathogen free,SPF)级 96 只 C57BL/6J Nifdc 新生小鼠 7 日龄,体重(5.2±0.5)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)-20180045],雌雄不限。 所有动物在宜宾市第二人民医院动物饲养中心动物饲养[SYXK(京)-2019-0105],并经本院伦理委员会批准(IACUC-20190018),实验过程符合3R 原则,且遵守视觉与眼科学研究会制定的关于科研动物规范。

1.2 主要试剂与仪器

miR-20a-5p agomir 购自广州锐博生物科技有限公司;引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成;实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)试剂盒购自赛默飞世尔,货号:K1622;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色试剂盒购自碧云天科技有限公司,货号:C0105;VEGF 抗体购自英国abcam 公司,货号:ab32152;眼科裂隙灯显微镜购自意大利CSO 公司,型号:SL990/SL980;氧箱购自宁波华仪宁创智能科技有限公司,型号:Attendor-110pro;qRT-PCR 仪购自美国ABI 公司,型号:ViiA7。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及OIR 小鼠模型建立

实验前对所有小鼠在眼科裂隙灯显微镜下检查眼部,均未发现异常。 实验分为正常组、模型组、高氧对照组、miR-20a-5p 高表达组,每组24 只。 除正常组外,其余各组参照文献[7]在出生后第7 天建立OIR 小鼠模型,测氧仪时刻监测氧浓度,小鼠置于氧浓度(75.00±2.00)%氧箱中,12 h 光照12 h 黑暗,高氧环境5 d 后置于常氧中饲养,在高氧环境结束前一天(出生后第11 天)开始,每组左眼作为阴性对照,右眼高氧对照组玻璃体腔内注射1 μL 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS),miR-20a-5p 高表达组右眼玻璃体腔内注射1 μL miR-20a-5p 激动剂(miR-20a-5p agomir)(1 μmol/L),处理完后立即置于氧箱中,模型组不进行任何处理,1 d 后所有小鼠出氧箱。 正常组小鼠一直置于空气中正常饲养。 高氧环境结束后各组小鼠正常空气再饲养5 d(出生后第17 天)进行实验。

1.3.2 qRT-PCR 检测视网膜组织 miR-20a-5p、VEGF、血管内皮生长因子受体(VEGF receptor,VEGFR)-1、VEGFR-2 表达情况

每组随机取8 只小鼠,右眼取视网膜组织,剪碎,加TRIzol 裂解。 氯仿、异丙醇法提取总RNA,并反转录为cDNA,参照qRT-PCR 试剂盒说明操作进行实验。 引物序列:miR-20a-5p F:5’-ATGCTAAA GTGCTTATAGT-3’、 R: 5’-CAGTGCAGGGTCCGAG GTATTC-3’, U6 F: 5’-CGCTTCGGCAGCAGCACA TATAC-3’、R:5’-AATTTGCGTGTCATCCTTGC-3’,VEGF F:5’-GCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTC CCA-3 ’、 R: 5 ’-GACCCTGGTGGACATCTTCCAG GAGTACCC-3 ’, VEGFR-1 F: 5 ’-CCACCTCCAT GTTTGAAGAC-3’、 R: 5’-TACCAGCAGTCTGCTG ACCTCCCC-3 ’, VEGFR-2 F: 5 ’-CTCCATCTTTT GGTGGGATG-3’、 R: 5’-AGGCCACAGACTCCCTG CTTTTACTG-3’, β-actin F: 5’-AAGACCTCTATG CCAACACAG-3’、R:5’-GGAGGAGCAATGATCTTG ATC-3’。 上样体系均为 20 μL:cDNA 1 μL(50 ng/μL),F/R(10 μmol/L)各 0.5 μL,2×Mix 10 μL,ddH2O 8.0 μL。 反应条件:95℃、10 min;95℃、15 s,62℃、30 s(miR-20a-5p)/60 s(VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2),40 个循环。 2-ΔΔCT法计算 miR-20a-5p、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 表达水平。

1.3.3 视网膜铺片观察视网膜血管形态

每组随机取8 只小鼠,右眼进行视网膜铺片。1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉小鼠,左心室灌注4%多聚甲醛5 min 立即摘除右眼并固定,去除眼前节,保留完整视网膜组织。 经漂洗、孵育、显色、甘油明胶封片,显微镜下观察并拍照。

1.3.4 HE 染色计数视网膜新生血管内皮细胞核情况

每组剩余8 只小鼠立即处死并摘取右眼,经4%多聚甲醛固定,切片后部分经脱蜡、复水、染色,再脱水、透明、封片进行HE 染色。 随机、双盲法显微镜下计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数量。 且仅计数与内界膜有紧密联系的细胞核,不计数与内界膜无联系的血管内皮细胞核。

1.3.5 免疫组化检测视网膜组织中VEGF 阳性细胞情况

1.3.4 中切片同HE 方法脱蜡、复水步骤,热修复抗原、5%脱脂奶粉封闭后,滴加一抗VEGF(阴性对照用同型同种鼠IgG 代替一抗)2 h,滴加二抗20 min 后DAB 显色,苏木素复染核,分色、脱水、透明、封片。 光学显微镜拍照。 每张切片在高倍显微镜下随机选择10 个视野,采用 MetaMorph/Evolution MP5.0/BX51 分析软件测量阳性细胞积分光密度(integrated od total,IOD)值。 阳性面积百分比=IOD/总面积×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析,计量数据均采用平均数±标准差()表示,先采用单因素方差分析各组间总体比较,若存在差异则使用SNK-q检验行组间两两比较。P＜0.05,差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-20a-5p 在各组小鼠视网膜组织中表达情况

与正常组相比,模型组、高氧对照组视网膜组织中miR-20a-5p 水平降低(P＜0. 05);分别与模型组、高氧对照组相比,miR-20a-5p 高表达组视网膜组织中miR-20a-5p 水平升高(P＜0. 05)。见表1。

2.2 miR-20a-5p 对小鼠视网膜血管形态的影响

正常组小鼠视网膜血管基本成熟,自视盘向周围发出放射状大血管,呈均匀分布,分支状态良好延伸至视网膜周边部位。 模型组和高氧对照组自视盘向周围发出的放射状大血管迂回、不规则扩张,出现大量新生血管,新生血管结构及分布紊乱,且周边毛细血管网闭塞。 miR-20a-5p 高表达组自视盘向周围发出的放射状大血管迂回不明显、不规则扩张减轻,新生血管明显减少。 见图1。

2.3 miR-20a-5p 对小鼠新生血管内皮细胞核数量的影响

与正常组相比,模型组、高氧对照组视网膜血管内皮细胞核数量升高(P＜0.05);分别与模型组、高氧对照组相比,miR-20a-5p 高表达组视网膜血管内皮细胞核数量降低(P＜0.05)。 见图2、表2。

表1 4 组小鼠视网膜组织中miR-20a-5p 表达水平比较( ,n=8)Table 1 Comparison of miR-20a-5p expression in retina of mice in 4 groups

表1 4 组小鼠视网膜组织中miR-20a-5p 表达水平比较( ,n=8)Table 1 Comparison of miR-20a-5p expression in retina of mice in 4 groups

注:与正常组相比,#P＜0.05;与模型组相比,*P＜0.05;与高氧对照组相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

组别Groups miR-20a-5p正常组Normal group 1.01±0.14模型组Model group 0.42±0.06#高氧对照组Hyperoxia control group 0.43±0.05#miR-20a-5p 高表达组miR-20a-5p overexpression group 1.38±0.15*&F P 146.368 0.000

2.4 miR-20a-5p 对小鼠视网膜组织中VEGF 阳性细胞的影响

VEGF 阳性表达呈棕黄色,模型组和高氧对照主要存在视网膜内界膜附近、神经节细胞层和内核层。 miR-20a-5p 高表达组主要存在神经节细胞层和内核层。 与正常组相比,模型组、高氧对照组视网膜中VEGF 蛋白阳性面积百分比升高(P＜0.05);分别与模型组、高氧对照组相比,miR-20a-5p 高表达组视网膜中VEGF 蛋白阳性面积百分比降低(P＜0.05)。 见图 3、表 3。

表2 4 组小鼠视网膜血管内皮细胞核数量比较( ,n=8)Table 2 Comparison of nuclear number of retinal vascular endothelial cells in 4 groups

表2 4 组小鼠视网膜血管内皮细胞核数量比较( ,n=8)Table 2 Comparison of nuclear number of retinal vascular endothelial cells in 4 groups

注:与正常组相比,#P＜0.05;与模型组相比,*P＜0.05;与高氧对照组相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

组别Groups血管内皮细胞核(个)Endothelial cell nucleus (n)正常组Normal group 3.16±0.16模型组Model group 25.35±3.15#高氧对照组Hyperoxia control group 25.94±3.47#miR-20a-5p 高表达组miR-20a-5p overexpression group 16.48±2.18*&F P 135.347 0.000

图1 4 组小鼠视网膜血管形态情况Figure 1 The morphology of retinal vessels in 4 groups

图2 4 组小鼠视网膜形态情况(HE 染色)Figure 2 Retinal morphology of the 4 groups of mice(HE staining)

2.5 miR-20a-5p 对小鼠视网膜组织中 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 水平的影响

与正常组相比,模型组、高氧对照组视网膜组织中 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表达水平升高(P＜0.05);分别与模型组、高氧对照组相比,miR-20a-5p 高表达组视网膜中 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表达水平降低(P＜0.05)。 见表 4。

3 讨论

OIR 表现为局部新生血管生成,会导致牵拉性视网膜脱落、并发性白内障、继发性青光眼等,还可引起斜视、弱视等并发症,影响患儿健康[8]。 本研究发现,与正常组相比,模型组小鼠视网膜组织视盘向周围发出的放射状大血管迂回、不规则扩张,大血管出现混乱,可能影响功能,促使出现大量新生血管,新生血管结构及分布紊乱,且周边毛细血管网闭塞,新生血管短暂时间内补偿大血管功能;但新生血管会破坏视网膜原有功能,诱发疾病。 及时有效的治疗是减少该病致盲的主要方法。

表3 4 组小鼠视网膜中VEGF 蛋白表达水平比较( ,n=8)Table 3 Comparison of VEGF protein expression in retina of 4 groups

表3 4 组小鼠视网膜中VEGF 蛋白表达水平比较( ,n=8)Table 3 Comparison of VEGF protein expression in retina of 4 groups

注:与正常组相比,#P＜0.05;与模型组相比,*P＜0.05;与高氧对照组相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

组别Groups 阳性面积百分比(%)正常组Normal group 3.15±0.46模型组Model group 63.85±13.05#高氧对照组Hyperoxia control group 65.03±12.34#miR-20a-5p 高表达组miR-20a-5p overexpression group 13.15±3.51*&F 102.470 P 0.000

VEGF 被认为是启动新生血管最为重要的细胞因子,可选择性地增强血管内皮细胞和淋巴管细胞的有丝分裂,促进内皮增生、迁移和分化,同时抑制内皮细胞老化和抗凋亡[9];可增加小静脉通透性,促使血浆大分子外渗,外渗蛋白可形成纤维蛋白原,从而支持内皮细胞生长,为建立新生血管网提供可能[10]。 VEGFR 作为 VEGF 受体,属跨膜酪氨酸激酶受体,其中VEFFR1 可介导内皮细胞迁移从而促进血管新生[11];VEGFR2 是VEGF 介导血管生成的主要受体,激活VEGFR2 可促进内皮细胞分裂、增殖,进而促进血管生成[12]。 在 OIR 中抑制VEGF 的表达可抑制 VEGFR2 的表达[13]。 本研究发现,与正常组相比,模型组VEGF 阳性表达呈棕黄色,主要存在视网膜内界膜附近、神经节细胞层和内核层,VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 水平升高,提示在OIR 视网膜组织中VEGF 及其受体均处于激活状态,VEGF 结合其受体增加小静脉通透性,促使血浆大分子外渗,外渗蛋白加速形成纤维蛋白原,加速内皮细胞迁移、生长过程,促进内皮细胞增生,加速新生血管生成,进而影响视网膜功能。

图3 4 组小鼠视网膜VEGF 蛋白表达情况(免疫组化染色)Figure 3 expression of VEGF protein in retina of 4 groups (immunohistochemical staining)

表4 4 组小鼠视网膜组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表达水平比较( ,n=8)Table 4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF, VEGFR-1 and VEGFR-2 in retina of mice in 4 groups

表4 4 组小鼠视网膜组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表达水平比较( ,n=8)Table 4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF, VEGFR-1 and VEGFR-2 in retina of mice in 4 groups

注:与正常组相比,#P＜0.05;与模型组相比,*P＜0.05;与高氧对照组相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜ 0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

组别Groups VEGF VEGFR-1 VEGFR-2正常组 Normal group 0.98±0.15 0.99±0.14 1.00±0.15模型组 Model group 4.15±0.31# 2.75±0.25# 1.98±0.08#高氧对照组 Hyperoxia control group 4.17±0.29# 2.76±0.24# 1.96±0.12#miR-20a-5p 高表达组miR-20a-5p overexpression group 1.38±0.25*& 1.93±0.17*& 1.32±0.09*&F 360.406 134.053 146.822 P 0.000 0.000 0.000

抗VEGF 已经成为治疗ROP 的重要靶位点之一[14]。 眼科血管疾病靶向治疗中主要策略为抗VEGF 抑制剂和miRNA 为核心的基因治疗[15],其中miRNA 作为单链小分子非编码RNA,参与转录后基因调控,在真核生物中存在广泛,且高度保守;构建miRNA 模拟物或抑制剂调节信号通路、靶基因等,抑制VEGF 通路或其受体表达可达到治疗疾病目的[16-17]。 miR-17-92 基因簇在人和小鼠的多种组织中广泛表达,包括 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-92-1[18]。 miR-17 和 VEGF 在血管性痴呆中关系密切,影响血管受损后修复、神经元损伤等过程[19]。 miR-20a 与血管新生关系密切,调节miR-20a 水平可以影响血管新生状况[20]。本研究发现,OIR 视网膜组织中miR-20a-5p 表达降低,升高miR-20a-5p 后可抑制视网膜组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA 水平,降低视网膜血管内皮细胞核数量,使放射状大血管迂回不明显,血管不规则扩张现象减轻,新生血管明显减少,从而改善血管状态。

综上所述,miR-20a-5p 可能抑制VEGF 通路减少OIR 小鼠视网膜血管新生,亦可能影响其他信号通路,从而减少OIR 小鼠视网膜血管新生,为OIR靶向治疗提供一定参考。