樊燕鑫 夏天卫 沈计荣△

膝骨关节炎(Osteoarthritis,OA)在骨科临床常见，其发病机制仍不明确且无良好疗法[1]。温肾宣痹方是诸方受教授创制的名方，临床应用广泛[2-4]。其治疗骨与关节退行性疾病[5-7]，及膝骨关节炎有较好疗效，但作用机制尚不清晰。膝骨关节炎的主要病理特征是软骨破坏，研究表明基质金属蛋白酶在膝骨关节炎关节软骨细胞外基质的降解及重构过程中发挥重要作用[8]，且前人发现miR-146a高表达能抑制NF-κB信号通路，延缓OA[9-10]，故设计实验探讨温肾宣痹方治疗膝骨关节炎的潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠(200～220 g)24只，上海西普尔-必凯实验动物有限公司(中国)，动物许可证批号为SCXK(沪)-2018-0006。

1.2 实验药物及试剂

水合氯醛(C104202，阿拉丁试剂(上海)有限公司，中国)；4%多聚甲醛(G1101，武汉谷歌生物科技，中国)；PBS(G002，赛维尔生物科技有限公司，中国)；番红-固绿染液(G1005，武汉谷歌生物科技，中国)；油红O(A600395，生工生物工程上海(股份)有限公司，中国)；异丙醇(A0004338，上海润捷化学试剂有限公司，中国)；无水乙醇(A0010074，上海润捷化学试剂有限公司，中国)；二甲苯(A0000542，上海润捷化学试剂有限公司，中国)；中性树脂(E675007，生工生物工程上海(股份)有限公司，中国)；0.9%生理盐水(H37022337，辰兴药业股份有限公司，中国)。纯净水(LA0727，飞净生物科技有限公司，中国)。温肾宣痹方：附子、桂枝、狗脊、细辛、茯苓、生薏苡仁、木香、天麻、山茱萸、泽泻、白术、生甘草的比例为 10∶10∶10∶10∶12∶15∶10∶10∶10∶10∶10∶10，由江苏省中医院制剂部提供。

1.3 实验仪器

microCT(skyscan1172，Bruker，比利时)；X-线放射仪(MX-20，Faxitron，美国)；生物洁净安全柜(BHC-1300 ⅡA/B3，苏州净化设备有限公司，中国)；脱水机(JJ-12J，武汉俊杰电子有限公司，中国)；包埋机(JB-P5，武汉俊杰电子有限公司，中国)；病理切片机(RM2016，徕卡仪器有限公司，德国)；冻台(JB-L5，武汉俊杰电子有限公司，中国)；组织摊片机(KD-P，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，中国)；烤箱(DHG-9140A，上海慧泰仪器制造有限公司，中国)；载玻片及盖玻片(10212432C，江苏世泰实验器材有限公司，中国)；倒置荧光显微镜(ECLIPSE Ni，Nikon，日本)；载玻片和盖玻片(10212432C，江苏世泰实验器材有限公司，中国)；电子天平(JA2003，上海舜宇恒平科学仪器有限公司，中国)；EDTA(E112486，阿拉丁试剂(上海)有限公司，中国)；NaOH(S140903，阿拉丁试剂(上海)有限公司，中国)。

1.4 方法

1.4.1造模与分组 采用改良Hulth法。首先将24只大鼠分为3组：空白组，实验组，对照组，每组各8只。实验组与对照组按大鼠体质量，用水合氯醛行腹腔注射麻醉，常规备皮、消毒，右侧髌旁内侧直切口逐层分离、切开右膝关节，打开关节腔，显露膝关节，将髌骨向外侧脱位后显露前交叉韧带，用手术刀前端切断前交叉韧带，并摘除内侧半月板。术中避免损伤软骨面，彻底止血后复位髌骨，逐层闭合切口。术后大鼠置于3～10 ℃环境中，相对湿度保持在70%以上，每天活动6 h以上。

1.4.2制作温肾宣痹方水煎剂 将上述药物按照处方比例投料，加10倍量水，水煎1次过滤药渣，冷凝浓缩至每毫升含温肾宣痹方1 g，如10 g温肾宣痹方饮片浓缩成10 mL煎液。依据相关文献把人的临床剂量转换为大鼠的给药剂量[11]，若人的临床剂量为xmg/kg，则大鼠的给药剂量=xmg/kg×70 kg×0.018/200 g=6.3xmg/kg。因温肾宣痹方临床使用日剂量为127 g，故确定温肾宣痹方实验组的给药剂量11 g/(kg·d)。

1.4.3干预方法 完成造模后的第2天开始，实验组给予温肾宣痹方灌胃处理，每次灌胃含温肾宣痹方水溶液(给药体积11 mL/kg)，每日一次，持续8周。对照组、空白组在每次给药处理时，灌胃给予相同剂量的纯净水(给药体积11 mL/kg)，1次/d，持续8周。

1.4.4标本制作方法 完成8周灌胃后的第2天，处死大鼠。每组各随机选取3只大鼠的膝关节，放入4%多聚甲醛保存，准备做病理。用手术刀片离断每组剩余5只大鼠膝关节的周围组织、前后交叉韧带，暴露胫骨平台，切取软骨、滑膜，并将软骨组织与滑膜组织放入冻存管，-80 ℃保存。准备进行病理检查的大鼠膝关节依次行多聚甲醛固定、脱钙、梯度脱水、透明、组织切片(切片厚度10 μm)、番红-固绿染色，进行镜下观察。

1.5 实验指标测定

每个膝关节组织选取至少5张切片，每张切片分别由两名研究者对大鼠切片进行国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分。最后对每个膝关节组织切片的OARSI评分结果取平均值并汇总统计。按照Trizol法提取总RNA，从软骨与滑膜组织里各提取1 μL RNA，按照TAKARA逆转录试剂盒说明书进行逆转录，并进行荧光定量。PCR荧光定量参数为95 ℃，扩增40个循环。检测软骨组织中MMP-1和MMP-13的表达量以及滑膜组织中miR-146a的表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

24只大鼠造模后均存活，并完成全部给药工作。

2.2 组织病理学结果

膝关节软骨组织切片(×100)番红-固绿染色结果显示：空白组膝关节关节面基本平滑，番红-固绿染色较深、均匀，软骨面无明显裂隙，OARSI评分较低(见图1)。实验组膝关节软骨表面基本平滑，软骨基质内较多空泡，番红染色较浅。OARSI评分较对照组低(见图1)。对照组膝关节软骨面接近剥脱，透明软骨几乎全部糜烂，软骨下骨暴露，番红染色缺失较多。局部可见软骨下骨增生，OARSI评分较高(见图1)。

图1 各组大鼠灌胃8周膝关节软骨组织切片番红-固绿染色结果比较(×100)

2.3 大鼠膝关节软骨PCR检测结果

提取各组大鼠膝关节软骨组织，行PCR检测，结果显示：实验组和对照组软骨组织中MMP-1表达水平相较空白组显著增加，实验组软骨组织中MMP-1基因的相对表达量相比对照组MMP-1基因的相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。实验组和对照组软骨组织中MMP-13表达水平相较空白组显著增加，实验组软骨组织中MMP-13基因的相对表达量相比对照组MMP-13基因的相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。实验组和对照组滑膜组织中miR-146a表达水平相较空白组显著降低，实验组滑膜组织中miR-146a的相对表达量相比对照组miR-146a的相对表达量显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 三组大鼠的OARSI评分及软骨组织中MMP-1基因、MMP-13基因、miR-146a相对表达量

3 讨论

骨性关节炎是一种以软骨损伤为基本病理改变的退行性疾病，与炎症密切相关。目前现代医学尚无有效的软骨保护相关药物。温肾宣痹方由桂枝附子汤、五苓散、麻杏薏甘汤加减而成。以桂枝、附子二药为君，助阳化气，温经散寒止痛；狗脊祛风除湿，补益肝肾；泽泻渗湿宣痹；茯苓、薏苡仁健脾利湿；白术、天麻益气健脾，祛风通络；木香行气止痛；山萸肉滋肾填精；细辛加强止痛之效力；甘草调和诸药，缓急止痛。全方共奏温补肾阳、宣痹通络、除湿散寒止痛之功。江苏省中医院已运用该方治疗骨性关节炎60余年，疗效确切。本研究前期研究发现温肾宣痹方中君药桂枝的活性成分桂皮醛在IL-1β诱导的SW1353细胞与人软骨细胞炎症中，能够发挥抗炎、软骨保护效果[7]。此外，温肾宣痹方中君药附子，臣药细辛、狗脊、薏苡仁，使药甘草也有一定的抗炎作用。

改良Hulth法是经典的骨性关节炎造模方法，该方法通过切断大鼠前交叉韧带与内侧半月板，破坏大鼠膝关节的稳定性达到诱发大鼠骨性关节炎的目的。本研究采用该法造模取得成功，并且本研究显示持续8周、灌胃温肾宣痹方的复方煎剂能够降低改良Hulth法建立的骨性关节炎大鼠膝关节的OARSI评分，减少软骨组织MMP-1、MMP-13的表达，保护关节软骨。

前期研究提示温肾宣痹方及其君药桂枝治疗骨性关节炎的作用机制与miRNA、TLRs/ NF-κB等炎症相关信号通路相关[9]。miR-146a被发现可调节免疫系统的微小RNA，其在骨性关节炎发病中的作用已被诸多研究证实[9]。研究显示关节滑膜组织中存在巨噬细胞，巨噬细胞中miR-146a可负反馈循环控制TLRs/NF-κB信号通路，抑制细胞因子与金属蛋白酶表达[10]。并且有研究发现在巨噬细胞中miR-146a低表达可激活经典的炎症信号转导通路NF-κB加剧炎症反应[11]，如在小鼠过敏性鼻炎中miR-146a上调可通过抑制TLR4/TRAF6/NF-κB信号通路发挥抗炎作用[12]。活化的转录因子NF-κB迁移至核内，与基因上的κB位点发生特异性结合，从而促进各种炎症因子的转录，释放大量炎症细胞因子，产生级联炎症反应。此外多项研究表明miR-146a下调参与促进M1巨噬细胞的极化，会加剧青少年特发性关节炎等疾病[13-14]。这提示温肾宣痹方可能通过增加关节滑膜组织里巨噬细胞中miR-146a的表达，抑制下游炎症通路，发挥治疗骨性关节炎作用。本研究显示持续8周、灌胃温肾宣痹方的复方煎剂能够增加滑膜组织中miR-146a的表达，是其保护软骨的作用机制。这提示下一步，在基础研究方面，可聚焦miR-146a，结合其上游的LncRNA PVT1及其下游的NF-κB信号通路，对温肾宣痹方治疗骨性关节炎的具体作用机制展开深入探讨。此外，考虑到温肾宣痹方目前尚未制成中成药，下一步可对温肾宣痹方进行现代剂型改革方面的研究。

总之，灌胃温肾宣痹方水煎剂对大鼠骨性关节炎软骨具有一定的保护效果，可延缓OA进程，具体机制与增加滑膜组织中miR-146a的表达、抑制炎症相关。