王 欣,刘天奇,徐 莹,张 会,李 杰

(东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨 150030)

脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)[EC 3.4.21.26]是一种脯氨酸特异性内切蛋白酶,能特异性水解多肽中脯氨酸残基或少数疏水性氨基酸残基的肽键[1]。广泛应用于医学[2]、食品[3]和酿造[4]等领域。在医学领域,脯氨酰内肽酶可加速肠道中谷蛋白的降解,是治疗乳糜泻的潜在药物[5-6];在食品领域,脯氨酰内肽酶可对酪蛋白水解物进行脱苦处理,从而提高食物的口感和营养价值;在酿造领域,在啤酒生产的过程中添加脯氨酰内肽酶可以提高麦芽汁中氨基酸的含量,提升口感,防治冷浑浊[7]。但是天然微生物中脯氨酰内肽酶表达量低,导致其生产成本高,无法大规模应用。目前市场上只有帝斯曼公司生产的食品级脯氨酰内肽酶产品,市场价格高达900元/公斤。因而研究脯氨酰内肽酶的重组表达具有重要意义。

表1 引物名称及其序列Table 1 Primer names and sequences

黑曲霉具有卓越的分泌蛋白能力,在工业发酵条件下分泌蛋白产量可达到40 g/L,并能进行糖基化等翻译后修饰。同时,又广泛应用于食品和发酵工业,具有高度的安全性和坚实的大规模发酵生产基础[8]。因此,黑曲霉是表达真核生物蛋白,尤其是食品级蛋白的理想系统。同时,天然的黑曲霉就能分泌脯氨酰内肽酶,所以黑曲霉是分泌表达食品级脯氨酰内肽酶的理想系统[9]。徐晓红等[10]在黑曲霉中表达了脯氨酰内肽酶,在5 L发酵罐试验中,酶活达到6.89 U/mL(酶活定义:pH5.0 37 ℃条件下每分钟从 Z-Gly-Pro-pNA释放1 μmol/L pNA所用的酶量为一个酶活力单位)。……