复方龙血竭口腔溃疡双层膜的制备及药效学初步研究

2021-06-15彭霜李江付鹏邹昱蕾陈凌云张韶湘

云南中医中药杂志 2021年4期

彭霜李江付鹏邹昱蕾陈凌云张韶湘

摘要：目的制備复方龙血竭口腔溃疡双层膜并对该制剂进行药效学初步研究，为该方进一步研究提供参考。方法采用单因素试验和L9（33）正交试验，优选最佳成膜处方，用匀浆流延成膜法制成复方龙血竭口腔溃疡双层膜，并对所制膜剂进行药效学初步研究。结果以2.5%乙基纤维素乙醇溶液作为空白隔离层成膜液，2.0%壳聚糖溶液和3.5%明胶-芦荟多糖溶液以2∶1配比混合作为药膜层，所制膜剂性状，工艺稳定。所制膜剂对大鼠口腔黏膜溃疡模型具有较好的治疗效果，愈合率较高。结论复方龙血竭口腔溃疡双层膜的处方设计合理，制备工艺稳定可靠，所制膜剂对口腔溃疡具有较好的治疗效果。

关键词：复方龙血竭口腔溃疡双层膜;口腔溃疡;制备工艺;药效学

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）04-0073-08

复发性口腔溃疡（Recurrent Aphthous Ulcer，RAU）又称为复发性阿弗他溃疡，是口腔黏膜常见的疾病，目前，复发性口腔溃疡发病机制尚且不明确。研究发现有10%～25%的人患病，特定人群患病率高达50%。RAU发病部位多为口腔黏膜，唇、颊及舌缘侧黏膜[1]。此病具有复发性、周期性、自愈性等特点[2-3]。有研究表明[4-10]：复发性口腔溃疡的发病机制与精神心理因素、饮食因素、免疫因素、遗传因素、口腔卫生因素、细菌因素等有关。其治疗方法主要有中医治疗、西医治疗、中西医结合治疗和其他治疗，以局部治疗为主。

“复方龙血竭”[11-12]处方来源于云南中医药大学第三附属医院（昆明市中医医院）经验方，由龙血竭、黄连、冰片组成，该方长期应用于临床，将复方药粉用水或醋调敷于口腔溃疡处，对于各种原因所致口腔溃疡具有良好的治疗效果[13]。但是使用过程中存在用药剂量难以控制，药物不易附着、药物味道极苦患者接受度差等问题，在一定程度上限制了该处方的合理化应用，为了解决以上问题，本实验将其制成由空白隔离层和药膜层复合而成的双层膜剂，并对其药效学进行了初步研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 CP124 C-电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）;分析天平（型号：AB265-SMETTLER TOLEDO，0.00001 g）;KMDOS-SK250H超声仪（上海科导超声仪器有限公司）;DK-98-IIA型双列八孔电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）、GZX-9070MBE型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;1mL一次性使用无菌注射器（带针）（陕西龙康鑫医疗器械有限公司）、烧杯、手术剪、解剖刀、10 mL离心管。玻璃板（10 cm×10 cm）;烧杯。

1.2 试药龙血竭、黄连、冰片均由昆明市中医医院提供;芦荟多糖（西安百川生物科技有限公司，批号：BCSW171117-1）;明胶（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：2091044）;壳聚糖（湖南新绿方药业有限公司，批号：17042001）;乙基纤维素（山东赫达股份有限公司，批号：20178117）;甲醇、石油醚、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙醇均为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）;环己烷、正丁醇均为分析纯（天津市风船化学试剂科技有限公司）;冰乙酸（天津市致远化学试剂有限公司）、甘油（广东光泽科技股份有限公司）;紫竹蜂胶口腔膜（华润紫竹药业有限公司，批号：24190710）;无水乙醇（天津市致远化学试剂有限公司）;甘油（广东光华科技有限公司）;冰乙酸;10 %中性福尔马林固定液;娃哈哈矿泉水。

1.3 实验动物 SD雄性大鼠（250～20）g（购自昆明医科大学实验动物中心，SCXK（滇）2019-0002）。

2 膜剂的制备

2.1 空白隔离层的制备根据实验前研究[11]配制质量分数为2.5 %的乙基纤维素乙醇溶液用匀浆流延法倒在干净的涂有少量液状石蜡的玻璃板上，制得白色薄膜，通过考察所制薄膜具有良好的成膜性、均匀性、柔韧性，同时薄膜不溶于水和唾液，无粘附性及刺激性，具有良好的隔离性能，将其作为复方龙血竭口腔溃疡膜的空白隔离膜层，如图1。

2.2 膜剂的制备通过考察，每1mL 95%乙醇溶液最多可溶解0.15 g复方药粉，称取复方龙血竭药粉，加入95%乙醇溶液配制成0.15 g/mL的复方药液，备用。称取壳聚糖加入1.0冰醋酸配制壳聚糖胶体溶液，称取明胶-芦荟多糖加入水-甘油（1∶1）配制明胶-芦荟多糖胶体溶液，将壳聚糖胶体溶液和明胶-芦荟多糖胶体溶液混合均匀，加入复方药液，用匀浆流延法[14]均匀涂铺于空白隔离层上，即得，复方龙血竭口腔溃疡双层膜，如图2，所制膜剂为红棕色的复合膜剂，气清香，味微苦。

2.2.1 膜剂成型工艺评价指标

2.2.1.1 外观评价[15] 对所制膜剂按以下标准进行外观评价，评价标准见表1。

综合分析膜剂的成膜性、柔韧性、均匀性、脱膜性，给出0～10分的分数。

2.2.1.2 粘力测试[11-14] 将膜剂放置于15°倾斜板上，用直径为1 cm，质量约为6.5 g的钢球从距离倾斜板顶端5 cm处自由落下，记录各实验组粘力测试中钢球滚落所需时间。粘力测试评分=钢球滚落时间/时间最小值。粘力评分越高，说明粘力越大。

2.2.1.3 溶解时间测试[11，14] 用装有100 mL水的烧杯放在磁力搅拌器上，设置37 ℃恒温水浴，取各组1 cm×1 cm的膜剂，分别用夹子固定在水浴中，设置转速为100 r/min，记录膜剂破碎或脱落的时间。参照（北京紫竹药业）蜂胶口腔膜的溶解时间。溶解时间评分=15 min/膜剂溶解时间。

3个评价指标（外观评价、粘力测试、溶解时间测试）权重比为1∶1∶1，综合评分=3个评价指标之和。综合评分越高，说明膜剂性能越好。

2.3 单因素试验

2.3.1 壳聚糖对药膜层成型工艺的影响称取壳聚糖加入1.0 %的冰醋酸溶液制成不同质量分数的壳聚糖溶液，制成药膜，通过对不同质量分数壳聚糖溶液所制得膜剂综合评价，分析壳聚糖对膜成型工艺的影响。结果显示壳聚糖质量分数越高，成膜时间越短，但是所制得药膜质量也相应变差，当壳聚糖质量分数为2.0 %时，所得膜剂性能最好。

2.3.2 明胶-芦荟多糖对药膜层成型工艺的影响称取明胶和芦荟多糖，分别配成2∶1、2.5∶1、3∶1的混合粉末，加入水-甘油（1∶1），配成不同质量分数的溶液，80 ℃水浴不断搅拌研磨成透明的胶状溶液，趁热加入到制好的2.0 %壳聚糖溶液中，与复方药液混合，制成药膜，对各组膜剂综合评价，考察不同比例的明胶-芦荟多糖的不同质量分数对药膜层成型工艺的影响。结果：质量分数为3.5 %明胶-芦荟多糖〗（2.5∶1）组所制药膜外观评分最高，所制膜剂性能最好。

2.3.3 载药量对药膜层成型工艺的考察配制壳聚糖和明胶-芦荟多糖混合溶液15 g，分别加入不同体积的0.15 g/mL复方药液，用匀浆流延法倒在涂有液体石蜡的干净玻璃板上，制成药膜。并对药膜进行评价，考察载药量对药膜层成型工艺的影响。结果：每15 g的壳聚糖和明胶-芦荟多糖混合胶体溶液溶液加入2 mL复方药液，所制膜剂性能最好。

2.3.4 正交试验在上述实验基础上，以2.0 %壳聚糖（A）、3.5 %明胶-芦荟多糖（2.5∶1）（B）、复方药液（C）加入量为因素，设计L9（3）表考察壳聚糖、明胶-芦荟多糖、复方药液加入量，以优化药膜层成型工艺。

由表3正交试验及结果可知，A1、B1、C2均值最大，分别是10 g壳聚糖溶液、5 g明胶-芦荟多糖（2.5∶1）溶液、2 mL复方药液。说明10 g壳聚糖胶体溶液与5 g明胶-芦荟多糖（2.5∶1）胶体溶液混匀加入2 mL复方药液所制得的药膜质量最佳，所以该组合为药膜层最佳成膜配方。

2.3.5正交试验验证称取乙基纤维素，加入无水乙醇，制成空白隔离层若干，备用;分别称取3份壳聚糖、明胶、芦荟多糖、复方药粉按正交试验结果制备复方龙血竭口腔溃疡膜。对所制药膜进行评价分析。

由表4正交试验验证结果可知，3组药膜外观评分均值为9.17，大于7.1，说明药膜成膜成膜性能良好，质量佳，综合评分均值为19.051分，接近正交试验最佳评分，且3组药膜综合评分的RSD（%）值为0.294 %小于2 %，说明复方龙血竭口腔溃疡膜成型工艺合理可行。

3 药效学初步研究

3.1 大鼠口腔黏膜刺激性考察

3.1.1 方法选用体重为（250±20）g的SD雄性大鼠9只，将大鼠随机分成3组，每组3只，分别为药膜（复方龙血竭口腔溃疡膜）组，阴性（不含药物的膜剂）对照组，正常对照组。药膜组和阴性对照组在给药时，先用10 %的水合氯醛溶液腹腔注射将其麻醉，剪0.5 cm×0.5 cm的膜贴在同一位置的口腔粘膜上，直到膜完全溶解。每日同一时间给药1次，连续7 d，正常对照组不作任何处理。末次给药1 h后处死大鼠，取出口腔黏膜。（1）肉眼观察有无充血、肿胀现象。因目前没有明确的口腔黏膜刺激性试验方法及评分标准，所以本试验参考直肠、阴道给药的粘膜刺激性试验方法。（2）取出的大鼠口腔黏膜用10%的福尔马林固定液浸泡，通过常规石蜡包埋、切片、厚度约为4～5 μm，染色，光学显微镜下观察其黏膜组织形态学有无改变，根据血管扩张、充血、出血及炎细胞浸润等指标评价病变程度[16-17]。

3.1.2 判断标准参照阴道给药的黏膜刺激性试验Eckstein刺激性评价标准，以试验动物给药部位的充血、肿胀、分泌物的轻重为指标进行评分，上述3个指标，每个指标按轻重程度分别判定为0～4分，0分为无刺激反应，4为严重刺激反应。平均分<3分，表示刺激性非常小，3.75～6.00分表示轻度刺激，6.75～9.00分为中度刺激，9.75～12.00分表示重度刺激。总分为0～6分为可接受，6.75～7.50分为边缘值，总分≥8.25分为不可接受[18]。

3.1.3 结果结果显示：3组大鼠口腔黏膜外观及口腔黏膜病理组织切片图无明显差异，说明复方龙血竭口腔溃疡膜对大鼠口腔黏膜无刺激性。见表5，图3和图4。

3.2 复方龙血竭口腔溃疡双层膜对实验大鼠口腔黏膜病理形态影响研究

3.2.1 分组与给药取60只大鼠，正常饲养1周，建立大鼠口腔黏膜溃疡模型。以10 %的水合氯醛（0.3mL/100 g）腹腔注射麻醉，用剪刀在大鼠的口腔粘膜上剪开伤口，用50 %的乙酸涂抹伤口，24 h后观察溃疡形成情况。涂抹部位呈白色或淡黄色，圆形或椭圆形溃疡，溃疡表面充血、水肿、中央略凹陷，说明溃疡形成。选择溃疡面积差别不大的大鼠若干，随机分为6组，每组10只，分别为A组（空白对照组，不造模正常饲养）、B组（模型对照组，造模但不给药）、C组（阳性对照组，紫竹蜂胶口腔膜，每只每次給药一片，1天2次，间隔12 h）;D组（复方龙血竭口腔溃疡膜高剂量组，每只每次给药1片，1天3次，间隔8 h）;E组（复方龙血竭口腔溃疡膜中剂量组，每只每次给药1片，1天2次，间隔12 h）;F组（复方龙血竭口腔溃疡双层膜低剂量组，每只每次给药1片，1天1次）。

每天同一时间给药。每天给药前记录溃疡面直径、充血红肿等情况。连续给药7 d，于第8 d每组随机处死5只，取大鼠口腔粘膜给药部位进行病理组织切片：用10 %的福尔马林固定液浸泡，通过常规石蜡包埋、切片、厚度约为4～5 μm，HE染色，光学显微镜下观察其粘膜组织形态学有无改变，根据血管扩张、充血、出血及炎细胞浸润等指标评价病变程度。

3.2.2 病理组织学检查评分标准[21] 溃疡面情况分级：0级为正常;I级（1～3分）未见或溃疡较小;Ⅱ级（4～6分）轻度溃疡;Ⅲ级（7～9分）中度溃疡;Ⅳ（10～12）分，重度溃疡，见表6。

3.2.3 结果

通过比较给药7天后各组大鼠口腔黏膜面积的变化情况、溃疡愈合情况及外观，可以看出除A组（空白对照组）外，其余各组大鼠口腔溃疡面积均有不同程度的减小。其中E组（中剂量组）大鼠口腔黏膜面积减小最为明显。

从各组大鼠口腔黏膜病理切片图可以看出：模型组大鼠口腔黏膜损伤明显，上皮细胞脱落明显，大量炎细胞浸润，局部有细胞坏死、变性等病理性变化，黏膜及黏膜下可见充血。与模型组对比，阳性药物组大鼠口腔黏膜溃疡组织病理性损伤相对减轻，上皮组织损伤无明显坏死，说明蜂胶口腔膜对于大鼠口腔粘膜溃疡有一定的治疗作用;复方龙血竭口腔溃疡双层膜高、中、低剂量组大鼠口腔黏膜溃疡组织病理性损伤有不同程度的减轻，说明复方龙血竭口腔溃疡双层膜对大鼠口腔黏膜溃疡有治疗作用，其中，中剂量组大鼠口腔黏膜溃疡愈合较为明显，部分已长出新的黏膜组织。说明复方龙血竭口腔溃疡膜能有效的促进大鼠口腔溃疡愈合，具有良好的治疗作用，中剂量给药治疗效果最佳。

4 讨论

本文建立了膜剂成型工艺评价指标，在前期研究基础上，对复方龙血竭口腔溃疡膜进行单因素试验，分别考察了处方中各因素对成型工艺的影响，进一步正交优化复方龙血竭口腔溃疡膜的成型工艺，最终确定复方龙血竭口腔溃疡膜的成型工藝，并进行工艺验证，结果表明复方龙血竭口腔溃疡膜成型工艺稳定可靠。

膜剂的制备过程中，笔者也对膜剂的干燥温度进行了考察，结果表明30 ℃恒温干燥得到的药膜质量最佳，最终选用30 ℃对药膜进行干燥。同时，各基质混合过程中不可避免地增多了气泡，使得膜剂产品气泡增多，所以在配制好药膜层成膜液时首先对其进行超声处理30 min，再用匀浆流延法均匀的涂布在空白隔离层上，从而有效地减少了成品中的气泡，提高了膜剂的质量。在实验过程中，也考察了空白隔离层对药物的隔离性能，结果显示，所制空白隔离层对处方药味具有良好的隔绝作用，大大地改善了膜剂的口感。

在药效学初步研究中，我们对两种大鼠口腔黏膜溃疡模型的建立方法进行了考察，分别是：（1）以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，用剪刀在大鼠的口腔黏膜上剪开伤口，用50 %的乙酸涂抹伤口，24 h后观察溃疡形成情况。（2）用10 % 水合氯醛麻醉后，取一个 6 cm 长的玻璃管，下端直径为 5 mm，内置一小棉球，使小棉球的底部与玻璃管下口取平，在管内滴入90%苯酚溶液至刚浸透小棉球为止。用玻棉球端在大鼠左口角内侧的颊黏膜上烧灼 60 s 使该区域产生白色损害，24 h后观察溃疡形成情况。结果显示：方法（1）用50 %的乙酸溶液所建立模型成功率高，溃疡面差异较小，而用方法（2）90%苯酚溶液所建立模型存在较大差异，成功率较低易增大实验误差，且操作较为复杂，增加了实验难度。最终选择方法（1）用50 %乙酸溶液建立大鼠口腔黏膜溃疡模型，并进行药效学初步研究。结果表明，复方龙血竭口腔溃疡双层膜可以有效地促进大鼠口腔溃疡的愈合，对于大鼠口腔粘膜溃疡具有良好的治疗效果。

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