杨丽华 王芳 余柯达 邹立波

剂量敏感的性别反转先天性肾上腺发育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal，adrenal hypoplasia critical region，on chromosome X，gene 1，DAX-1），又称NR0B1（nuclear receptor subfamily 0，group B，member 1）是编码核受体超家族1蛋白的成员。人类DAX-1 基因位于X染色体p21，编码一个含470个氨基酸的蛋白质，是一种转录因子，主要在哺乳动物的生殖系统中表达，如睾丸、卵巢、下丘脑、垂体、肾上腺等［1］。已有研究证明肾上腺发育不全、促性腺激素分泌不足的性腺机能减退及男性不育症的发病与DAX-1突变有关［2-3］。本研究拟构建人DAX-1 的真核表达载体，并利用双荧光素酶报告系统检测其转录活性，为后续研究DAX-1突变致病及DAX-1表达调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肾上腺皮质瘤细胞（Y-1）购自中科院上海细胞库，人睾丸组织的RNA、高保真DNA聚合酶购自Takara公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司，限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、柱回收试剂盒购自Omega公司，引物合成及DNA测序于上海英潍捷基贸易有限公司完成，脂质体 LipofectamineTM2000、载体购自Invitrogen 公司，双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司，DMEM 培养液、胎牛血清（FBS）购自Gibco 公司，培养皿、培养板、移液管等耗材均购于Corning公司。

1.2 方法 （1）人DAX-1基因cDNA编码区全长序列的获取根据Gene bank中DAX-1的序列用 Prime premier 5.0 软件设计引物。DAX-1引物序列：上 游5'CCCAAGCTTATGGCGGGCGAGAAC 3'下 游5'CGCGGATCCCGTATCTTTGTACAG 3'分别在上游和下游引物的5'端加上Hind Ⅲ和BamH1酶切位点。将人睾丸组织RNA逆转录合成cDNA，方法参照Fermentas反转录试剂盒说明书。以cDNA为模板进行PCR反应，反应体系：cDNA（0.1 µg/µl）：1 µl；5×Prime STAR GXL Buffer：10 µl；dNTP Mixture（2.5 mM each）：4 µl；primer F（10 pM）：1 µl；primer R（10 pM）：1 µl；Prime STAR GXL DNA Polymerase：2 µl；H2O：31 µl；总体积50 µl。PCR循环条件：①98℃ 2 min；②98 ℃10 s；③60 ℃15 s；④68℃1 min 45 s；⑤重复②~④步骤，进行30个循环；⑥68 ℃ 5 min；⑦4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物大小。（2）重组质粒pcDNA3.1（+）-3'HA-DAX1的构建：用胶回收试剂盒回收扩增的PCR产物，用Hind Ⅲ-HF和BamH1-HF分别双酶切PCR产物和带HA多肽标签的pcDNA3.1（+）' 37℃ 4 h。……