马铭泽，史凤显，翟若南，王 航，李 珂，许春艳，牛 淑，姚 武，周 舫

郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室 郑州 450001

肺癌的增殖、侵袭和转移过程往往伴随着上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程[1-2]。EMT上皮细胞在形态学上发生向间(充)质细胞表型转变并获得迁移能力，在胚胎生长、组织重塑、肿瘤转移等过程中起着至关重要的作用[3-4]。EMT被认为是组织、器官等纤维化进程的主要原因，也是增强肺癌细胞侵袭其他器官和转移能力的重要过程[5]。因此，探讨肺癌细胞的EMT进程对于肺癌的防治具有重要意义。

转化生长因子β( transforming growth factor β，TGF-β)是一种多功能细胞因子，在细胞和组织的生长、发育、分化中起关键作用，对细胞的增殖、分化、凋亡，细胞间质产生，胚胎发育，器官形成，免疫功能，炎症反应，创伤修复等有重要的调节作用，同时可以诱导细胞EMT[6-7]。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是细胞在受到高温刺激及其他环境因素如毒素、氧压、营养缺乏、重金属、强紫外线照射等刺激后，所产生的高度保守并具有防御作用的一组蛋白质[8-9],对细胞的分化、增殖等过程具有调节作用。研究[10-11]发现替普瑞酮作为HSP70诱导剂，在大鼠胃黏膜细胞中能诱导HSP70高表达并对细胞起到保护作用，并在其他器官中如心、脑、肝等组织中也有相同的作用。本研究选择用TGF-β刺激A549细胞建立EMT细胞模型，用替普瑞酮诱导HSP70高表达，探讨HSP70在TGF-β诱导的人肺腺癌A549细胞EMT进程的作用，为肺癌的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂人肺腺癌细胞A549细胞购自中国科学院。二甲基亚砜(DMSO)、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，RPMI 1640培养基(北京索莱宝科技有限公司)，胎牛血清(美国GEMINI公司)，TGF-β(美国Peprotech公司)，替普瑞酮(美国MCE生物公司)，HSP70、E-cadherin、Vimentin蛋白一抗(按1∶1 000稀释，美国Cell Signaling Technology公司)，GAPDH一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，DYCZ-24DN电泳仪(北京六一仪器厂)，自动酶标仪(美国Bio Teck公司)。

1.2细胞培养采用含体积分数为10%胎牛血清和含青霉素、链霉素双抗的RPMI 1640培养基，在37 ℃、含体积分数5%CO2、95%湿度条件下，对A549细胞进行复苏、传代、培养，待细胞达到80%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3替普瑞酮诱导A549细胞HSP70表达的最佳作用条件用0、25、50、100、200 μmol/L的替普瑞酮处理A549细胞，24 h后收集细胞提取蛋白，采用Western blot法检测HSP70的表达，同时利用细胞增殖活性实验检测A549细胞的活性，筛选出替普瑞酮诱导HSP70高表达的最佳作用条件。

1.4实验分组将A549细胞分为4组：对照组，只加入RPMI 1640培养基；TGF-β组，加入5 μg/L的TGF-β和RPMI 1640培养基；TGF-β+替普瑞酮组，加入5 μg/L的TGF-β、50 μmol/L的替普瑞酮和RPMI 1640培养基；替普瑞酮组，加入50 μmol/L的替普瑞酮和RPMI 1640培养基。作用24 h后，收集细胞。

1.5EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin的Westernblot检测将A549细胞接种到6孔板中，待细胞融合达80%后，清洗细胞，并根据1.4中实验分组进行相应处理。24 h后，收集细胞，用含PMSF的裂解液提取蛋白，将蛋白质样品与上样缓冲液混合煮沸5 min变性。之后进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜。PVDF膜用50 g/L脱脂奶粉混合TBST缓冲液封闭2 h，4 ℃下与一抗孵育12 h，用TBST缓冲液漂洗后加入二抗，置于摇床上常温慢速孵育 2 h，洗膜后用超敏ECL化学发光显色试剂显影并曝光。利用Quantity One软件定量分析条带的灰度值。以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.6迁移能力检测将A549细胞接种到到6孔板中，待细胞融合达80%后，用枪头在6孔板中间细胞表面做一条划痕，用PBS缓冲液清洗3遍，并在显微镜(×100)下观察细胞形态及划痕宽度，不同组别分别处理24 h，再于显微镜下进行观察并拍照，对图片用Photoshop软件进行分析，结果用相对宽度来表示。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0进行分析。不同浓度替普瑞酮诱导A549细胞后的细胞活性、4组细胞EMT相关蛋白表达和细胞迁移能力的比较采用2×2析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1替普瑞酮最佳作用条件与0 μmol/L替普瑞酮处理比较，20、50 μmol/L替普瑞酮处理的A549细胞HSP70的表达升高(图1、表1)；结合不同浓度替普瑞酮处理对细胞活性的影响，选择50 μmol/L的替普瑞酮进行后续实验。

1～5：分别为0、25、50、100和200 μmol/L的替普瑞酮处理

表1 不同浓度替普瑞酮处理对A549细胞HSP70表达和细胞活性的影响(n=3 )

2.2 4组A549细胞EMT相关蛋白表达的比较见图2、表2。替普瑞酮促使A549细胞E-cadherin蛋白表达升高，Vimentin蛋白表达下降；TGF-β促使E-cadherin蛋白表达降低，Vimentin蛋白表达升高。替普瑞酮可拮抗TGF-β的作用。

1～4：分别为对照组、TGF-β组、TGF-β+替普瑞酮组和替普瑞酮组

2.3 4组细胞迁移能力比较见表2。TGF-β促使A549细胞迁移能力增强；替普瑞酮促使细胞迁移能力下降；替普瑞酮可拮抗TGF-β的作用。

表2 4组细胞EMT相关蛋白表达和细胞迁移能力的比较(n=3)

3 讨论

目前，肺癌在全球范围内的病例和死亡人数依然呈上升趋势，肺癌细胞的转移扩散是导致肺癌患者死亡的首要原因[1]。因此，控制肺癌细胞向机体其他器官的迁移和扩散是治疗肺癌的重要措施[12]。EMT是肺癌细胞迁移发生的关键点，这个过程中胞质骨架会重新构建，细胞间的连接能力减弱，进而促进了细胞的迁移[13]。目前的研究[14-15]表明，EMT在多种细胞的迁移过程起到了很大的作用。

本研究结果显示25、50 μmol/L替普瑞酮处理的A549细胞中HSP70蛋白的表达均升高；结合不同浓度替普瑞酮处理对A549细胞活性的影响，我们选择50 μmol/L替普瑞酮进行后续的实验。

HSP70作为HSP家族的核心成员而被广泛研究，作为分子伴侣它参与蛋白的折叠、成熟过程。研究[16]发现，在大鼠腹膜间质细胞中，HSP70能作用于MAPK/ERK和TGF-β/SMAD信号通路，进一步抑制由糖基化最终产物诱导的细胞EMT进程；HSP70也能通过减弱TGF-β介导的SMAD2磷酸化进而调控HEK293T和HaCaT细胞的EMT进程[17]，因此我们推测高表达的HSP70对A549细胞的EMT进程也起到抑制作用。EMT进程中，常伴随着E-cadherin蛋白表达降低而Vimentin蛋白表达增加[3]。本研究结果显示，TGF-β促使A549细胞E-cadherin蛋白表达降低，Vimentin蛋白表达升高；替普瑞酮拮抗了这一作用。HSP70或许成为一个可以调控的潜在靶点进而影响A549细胞的EMT进程。

有研究[18]表明，HSP70参与了细胞的迁移进程，如在HeLa细胞中，沉默HSP70 的表达能促进细胞的迁移[19]；在人肺动脉内皮细胞中，高表达的HSP70能够有效抑制细胞内活性氧的产生进而抑制细胞的迁移作用[20]；但是在胶质瘤细胞中，HSP70的高表达对细胞的迁移有着促进作用[21]，可能是不同种类的细胞导致的差异。本研究结果显示，TGF-β促使A549细胞迁移能力增强，替普瑞酮拮抗了这一作用，这与在HeLa细胞和人肺动脉内皮细胞中的实验结果是一致的，提示HSP70可能作为抑制细胞迁移的重要靶点。

综上所述，在TGF-β诱导的A549细胞模型中，高表达的HSP70能抑制A549细胞EMT进程，并减弱细胞迁移能力。