杨 阳,刘福荣，崔留欣,黄 辉,李福琴

1)郑州大学第一附属医院医院感染管理科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院病案管理科 郑州 450052 3)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 450001

近年来，世界男性精子质量呈逐年下降趋势，不育症的发病率逐年升高[1]。持续霾天气对男性生殖功能的影响引起相关学者的关注[2]。细颗粒物(PM2.5)是造成健康风险最主要的大气污染物之一，其极易富集多种有害物质并随呼吸进入体内，直接或间接对机体多个系统造成损伤[3]。目前PM2.5对机体损伤的研究主要集中在呼吸系统、心血管系统和神经系统，有关其对雄性生殖系统损伤的研究尚处于探索阶段。

内质网应激对精母细胞、睾丸结构及精子有影响，对雄性生殖有重要调节作用[4]。肌醇需求酶1(IRE1)是内质网应激的感应蛋白之一，属于内质网膜Ⅰ型跨膜蛋白，严重或长时间内质网应激可引起IRE1过量表达，进而激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)表达[5]。本研究拟通过建立PM2.5暴露雄性大鼠生殖损伤模型，观察采用IRE1抑制剂干预后，大鼠精子质量、组织形态、细胞凋亡、IRE1和JNK蛋白表达的变化，探讨PM2.5是否通过激活IRE1-JNK通路介导生殖损伤，为PM2.5致雄性生殖损伤的防治提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1PM2.5采样和处理2018年10月至2019年2月在郑州市交通繁忙路段用大流量采样器采集环境颗粒物，使用石英纤维滤膜进行采样。将载有PM2.5的滤膜裁成1 cm×1 cm大小，浸泡于去离子蒸馏水中，超声振荡30 min×3次，振荡液经6层纱布过滤，12 000 r/min、4 ℃离心30 min，所得细颗粒悬浮液经真空冷冻干燥处理后，储存于-20 ℃备用。根据实验需求在使用前24 h内用无菌生理盐水将PM2.5配成所需浓度后4 ℃保存，临用前振荡使颗粒物充分混匀。

1.2实验动物来源及分组4周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体重90～110 g，由河南省实验动物中心提供，实验动物许可证编号：SCXK(豫)2017-0001。IRE1抑制剂STF083010购自美国MCE公司。大鼠于SPF级动物房饲养，自由饮水，经检疫1周无异常后，采用随机数字表法分成4组，每组10只。空白对照组气管滴注生理盐水；STF083010组腹腔注射1 mg/kg STF083010；PM2.5组气管滴注PM2.5，剂量1.5 mg/kg；STF083010+PM2.5组先腹腔注射STF083010，后气管滴注PM2.5。每周连续给药5 d，停2 d，染毒时间为4周。

1.3标本取材染毒结束后，称取大鼠体重，麻醉并处死后，立即打开腹腔，取睾丸、附睾，抽取腹主动脉血用于以下观察和检测。

1.4睾丸组织形态学观察采用HE染色。取单侧睾丸，置于体积分数10%甲醛中固定48 h，随后依次进行组织浸蜡、切片、脱蜡水化、染色、脱水透明，干燥后于400倍光学显微镜下观察生精上皮细胞形态结构、管腔细胞脱落情况等。

1.5睾丸组织细胞凋亡检测采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)检测睾丸组织细胞凋亡情况，操作过程按照试剂盒说明进行。于400倍光镜下观察，正常细胞为蓝紫色，凋亡细胞为棕色并出现染色质浓缩、凋亡小体、细胞皱缩等。取3个视野，细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.6血清睾酮含量检测取腹主动脉血约5 mL，3 000 r/min离心15 min，小心吸取血清，-20 ℃保存备用。采用ELISA法检测血清睾酮含量，试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司，具体按试剂盒说明操作。

1.7精子质量分析用眼科镊剥离一侧附睾尾，制备精子滤液。采用电脑精子分析仪分析精子密度。于400倍光镜下观察精子活动率。取3个视野，精子活动率=活动精子数/(活动精子数+无活动精子数)×100%。于400倍光镜下观察精子形态，以大头、双头、双尾、卷尾、无钩、香蕉形为精子畸形判断依据。精子畸形率=畸形精子数/(正常精子数+畸形精子数)×100%。

1.8睾丸组织IRE1-JNK通路相关蛋白检测取适量睾丸组织制备组织匀浆，加入裂解缓冲液，12 000 r/min、4 ℃离心5 min。吸取上清即为提取的睾丸组织总蛋白，用BCA法测蛋白浓度。总蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，转移到PVDF膜上。分别加入IRE1、JNK、p-JNK兔多克隆抗体(美国Immunoway 公司，均按1∶1 000稀释)，4 ℃摇床振荡过夜，次日加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h，用ECL化学发光法显色，Bio-Rad凝胶成像系统采集图像，Quanlity one软件分析蛋白条带灰度值。以β-actin为内参，目的蛋白条带与内参条带灰度值的比值即为目的蛋白的相对表达量。

1.9统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。4组大鼠的精子质量，血清睾酮含量，睾丸组织细胞凋亡率以及IRE1、JNK和p-JNK蛋白表达水平的比较采用2×2析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠睾丸组织形态学观察结果空白对照组(图1A1)生精细胞形态结构完整，生精小管充实饱满，管壁光滑无皱褶，管腔细胞无脱落。STF083010组(图1B1)生精小管排列规则，结构正常，由不同发育阶段的生精细胞和支持细胞组成，在生精小管间的睾丸间质内，可见圆形或多边形的睾丸间质细胞。PM2.5组(图1C1)生精细胞间结构较为疏松，管内细胞间隙变大，生精上皮退化变性，细胞层数较空白对照组减少。STF083010+PM2.5组(图1D1)生精细胞结构基本完整，管内细胞排列疏松但尚规则，管腔脱落细胞较PM2.5组减少。

A：空白对照组；B：STF083010组；C：PM2.5组；D：STF083010+PM2.5组；1：形态学观察；2：细胞凋亡情况

2.2各组大鼠血清睾酮含量和睾丸组织细胞凋亡率的比较结果显示，PM2.5可引起血清睾酮含量降低，睾丸组织细胞凋亡率升高；STF083010可拮抗PM2.5导致的血清睾酮含量下降和细胞凋亡，见表1。各组大鼠睾丸组织细胞凋亡情况见图1。

表1 各组大鼠睾丸组织细胞凋亡情况

2.3各组大鼠精子质量分析PM2.5可降低精子密度及精子存活率，增高精子畸形率；而STF083010可拮抗PM2.5导致的精子密度、精子存活率降低及精子畸形率升高，见表2。

表2 各组大鼠精子质量结果比较

2.4各组大鼠睾丸组织中IRE1、p-JNK蛋白表达水平的比较见图2、表3。PM2.5上调了IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达水平，而STF083010抑制了PM2.5介导的IRE1、p-JNK蛋白表达的上调。

1～4:分别为空白对照组、STF083010组、PM2.5组、STF083010+PM2.5组

表3 各组大鼠睾丸组织中IRE1、JNK、p-JNK蛋白的表达

3 讨论

PM2.5是霾形成的主要因素之一，治理霾的关键就是解决PM2.5问题。PM2.5粒径小，比表面积大，易吸附重金属等有毒有害物质，而生殖系统是重金属毒害作用的主要靶器官之一[6]。意大利一项回顾性队列研究[7]评估了空气污染对精子参数的影响，结果显示，PM2.5暴露水平与精子总数呈显著负相关。文献[8]分析了2013至2015年武汉地区大气颗粒物与男性精子质量的暴露-反应关系，结果表明，PM2.5暴露浓度与精子质量呈负相关，尤其是精子浓度和精子数量。本研究选择4周龄SD雄性大鼠，PM2.5染毒4周后，睾丸组织形态结构破坏，生精细胞数减少；睾丸组织细胞凋亡率升高；精子密度及精子存活率降低，精子畸形率升高；血清睾酮含量降低。上述证据进一步证实了PM2.5可引起雄性生殖损伤。STF083010与PM2.5联合作用后大鼠精子质量﹑血清睾酮含量有所升高，睾丸组织病理损伤有所减轻，凋亡细胞减少，提示STF083010干预可拮抗PM2.5暴露引起的雄性大鼠生殖损伤。

目前PM2.5暴露对睾丸损伤的作用及其确切调控机制尚未完全阐明。有学者[9]研究发现，汽车尾气来源的PM2.5通过激活PI3K/AKT信号通路，诱导睾丸支持细胞活性氧水平升高、细胞功能异常，破坏血睾屏障的完整性，最终导致生殖功能损伤。IRE1是内质网应激的感应蛋白之一。当出现严重或长时间内质网应激时，可引起感应蛋白IRE1的过量表达，活化的IRE1可与细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)形成IRE1-TRAF2-ASK1复合物，进而激活JNK[10]。本研究发现，PM2.5诱导可使大鼠睾丸组织中IRE1、JNK和p-JNK蛋白表达增强；采用IRE1抑制剂STF083010干预，在拮抗IRE1的同时，有效抑制了p-JNK蛋白表达水平，提示PM2.5可能通过活化IRE1、JNK介导雄性大鼠生殖损伤。

综上，抑制IRE1-JNK通路可能能减轻PM2.5介导的雄性大鼠生殖损伤，这为PM2.5致生殖损伤的预防和治疗提供了线索和思路。另外，JNK为MAPK家族的重要成员之一，除了与IRE1有关联，还与自噬、氧化应激、线粒体及炎症因子等多条信号通路有关[11]。JNK通路是否介导了其他信号通路共同参与PM2.5暴露后的生殖损伤，有待进一步探讨。