闫红娟，马晓平，李 曼，张 楠，郁晓丹，徐 江

信号素3A(SEMA3A)是信号蛋白家族成员中第一个被研究的潜在肿瘤抑制因子，其被认为是一个候选的抑癌基因。近期研究表明，SEMA3A在不同类型肿瘤，如黏液表皮样癌[1]、舌鳞状细胞癌[2]、头颈部鳞状细胞癌[3]、胃癌[4]、前列腺癌[5]等中均呈低表达。SEMA3B是信号蛋白家族成员，具有抑制肿瘤细胞的功能，是一个位于染色体3p21.3区域的抑癌基因。SEMA3B在黏液表皮样癌[1]、食管鳞状细胞癌[6]、胃癌[7]等多种恶性肿瘤中均呈不同程度的表达缺失和下调。故采用免疫组化法检测SEMA3A和SEMA3B蛋白的表达具有重要意义。抗原修复技术是影响免疫组化染色的重要因素[8]，不同抗原修复法会直接影响SEMA3A和SEMA3B的免疫组化染色质量。选择合适的抗原修复方法是免疫组化成功与否的关键，尤其是关于抗原修复方法和修复液的选择，目前，高压修复和微波修复是两种最常见的热修复方法，枸橼酸缓冲液和EDTA缓冲液是最两种常使用的修复液。免疫组化染色显示SEMA3A和SEMA3B表达主要定位于细胞质。为了更好的展示细胞质抗原免疫组化染色效果，本实验选择了不同的热修复方法和修复液，对上述细胞质蛋白进行免疫组化检测，寻找最佳的修复方法，以提高细胞质抗原染色的准确性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂收集2015～2020年石河子大学医学院第一附属医院手术切除的口腔鳞状细胞癌癌旁正常组织标本40例，所有病例病理诊断明确。Olympus BX51图像分析仪；2.5 L高压锅；美的家用微波炉；SEMA3A抗体(1 ∶200，Abcam公司，Cambridge，UK)、SEMA3B抗体(1 ∶500，Abcam公司，Cambridge，UK)；EnVision检测试剂盒(Dako公司)；DAB显色试剂盒(Dako公司)；枸橼酸缓冲液(pH 6.0)和EDTA缓冲液(pH 9.0)为本实验室所配制。

1.2 方法将蜡块组织连续切片，切片插入切片架内置于65 ℃的电热恒温干燥箱中烘烤2 h以上，防止掉片。按照免疫组化EnVision法染色步骤操作。将脱腊至水的切片在同一实验条件下、同一时间内进行抗原修复，根据抗原修复条件不同，分为高压-EDTA缓冲液修复组、高压-枸橼酸缓冲液修复组、微波-EDTA缓冲液修复组、微波-枸橼酸缓冲液修复组。

抗原修复：使用热修复方法，修复液使用EDTA缓冲液或枸橼酸缓冲液。高压修复：将修复盒内的EDTA缓冲液(或枸橼酸缓冲液)及高压锅中的水分别加热至沸腾，随后将切片依次插入修复盒内的切片架上，修复盒放入高压锅的置物架上，高压锅加盖，电磁炉1 800 W加热至喷气，调至800 W计时8 min后关闭电源，放气并取出修复盒，修复盒置于室温下自然冷却至30 ℃～40 ℃；微波修复：将修复盒内的EDTA缓冲液(或枸橼酸缓冲液)置于微波炉中高火煮至沸腾，将切片依次插入修复盒内的切片架内，修复盒放入微波炉中低火加热30 min，取出修复盒，修复盒置于室温下自然冷却至30 ℃～40 ℃。

切片浸入新鲜配制的3%双氧水中，室温下孵育10 min，蒸馏水冲洗3次，PBS震洗3次，每次5 min，各组切片分别滴加100 μL最佳工作浓度的一抗，湿盒置于4 ℃冰箱中孵育过夜，室温下复温，PBS震洗，每张切片上滴加100 μL二抗后，37 ℃恒温箱中孵育30 min，PBS震洗，DAB显色，苏木精复染，自来水蓝化，透明，封固。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定SEMA3A、SEMA3B主要定位于细胞质，呈黄色或棕黄色为阳性。SEMA3A、SEMA3B染色参照标准[1]：光镜下观察阳性细胞百分比和染色强度。(1)按阳性细胞占所观察细胞的百分比计分：阳性细胞百分比≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。(2)按阳性细胞染色强度计分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。每个标本最终的阳性或阴性结果由两种计分方法的乘积来判定：≤3为阴性，>3为阳性。

2 结果

2.1 不同抗原修复方法对口腔鳞状细胞癌癌旁正常组织中SEMA3A染色的影响SEMA3A蛋白以口腔鳞状细胞癌癌旁正常组织细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。使用不同抗原修复方法及修复液修复后，高压修复的免疫组化染色阳性强度高于微波修复法。高压-EDTA缓冲液修复组阳性强度最强，细胞质明显着色，定位准确，表达效果最理想(图1A)。高压-枸橼酸缓冲液修复组、微波-EDTA缓冲液修复组阳性强度下降(图1B、C)。微波-枸橼酸缓冲液修复组阳性强度最弱，效果不理想(图1D)。

图1 SEMA3A抗体：A.高压-EDTA缓冲液修复组；B.高压-枸橼酸缓冲液修复组；C.微波-EDTA缓冲液修复组；D.微波-枸橼酸缓冲液修复组 图2 SEMA3B抗体：A.高压-EDTA缓冲液修复组；B.高压-枸橼酸缓冲液修复组；C.微波-EDTA缓冲液修复组；D.微波-枸橼酸缓冲液修复组

2.2 不同抗原修复方法对口腔鳞状细胞癌癌旁正常组织中SEMA3B染色的影响SEMA3B蛋白以口腔鳞状细胞癌癌旁正常组织细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。使用不同抗原修复方法及修复液修复后，高压-EDTA缓冲液修复组染色均匀，背景清晰，对比明显，染色效果最理想(图2A)。高压-枸橼酸缓冲液修复组阳性强度提高，但出现背景着色，染色效果欠佳(图2B)；微波-EDTA缓冲液修复组阳性强度明显提高，但普遍出现背景着色且背景染色深(图2C)。微波-枸橼酸缓冲液修复组背景染色深，出现假阳性，效果不理想(图2D)。

3 讨论

免疫组化技术是对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位定性、定位或半定量研究[9]。石蜡包埋组织经甲醛固定，组织中蛋白质的氨基与固定液中的醛基交联，导致部分蛋白抗原簇被封闭，从而在一定程度上影响组织染色效果[10]。通过抗原修复可以使抗原决定簇重新暴露并与抗体有效结合，因此抗原修复是影响组织染色效果的最关键因素。不同修复方式均有各自的优点和局限性，应当依据抗原特性选择合适的修复方法，以取得最佳修复效果。本实验选用不同的抗原修复方式和抗原修复液，检测SEMA3A和SEMA3B蛋白的表达，其中SEMA3A蛋白经高压修复的免疫组化染色阳性强度高于微波修复。高压-EDTA缓冲液修复组阳性强度最强，细胞质明显着色，定位准确，表达效果最理想。SEMA3B蛋白经高压-EDTA缓冲液修复组染色均匀，背景清晰，对比明显，表达效果最理想。因此，用高压-EDTA缓冲液作为SEMA3A和SEMA3B抗原修复方法能够取得较理想的染色效果，值得推广。

临床上关于抗原修复方式的报道较多，常见的有微波、高压、电炉加热、酶消化等[11]。高压和微波修复法是目前应用最广泛的组织抗原修复法，效果较为肯定[9,12]。高温高压热修复法是最有效、最稳定的抗原修复方法[13-14]。本实验通过对组织进行高压及微波处理的对照实验中发现，高温高压抗原修复法的修复效果明显优于微波抗原修复法；与李绍刚等[15]和袁士成等[16]的研究结果一致。由于微波热修复过程中的微波焦点范围小，组织切片接收到的微波辐射量少且不均匀，并且不同区域的组织处理强度不一致，导致不同区域染色深浅不同，边缘效应比较明显。高压热修复法热效率高且均匀；暴露抗原决定簇效果优于微波修复，这使得弱阳性、假阴性的组织获得更可靠、更准确地表达，组织阳性定位准确，染色均匀，特异性强，结果稳定，背景着色较弱，可以提高抗原抗体阳性检测率，操作简便，节省时间，阳性率较微波抗原修复法高。但高压法的缺点是容易脱片或使组织出现大小不等的缺损。

目前，常用的抗原修复液有EDTA修复液和枸橼酸修复液。本实验中分别采用枸橼酸缓冲液和EDTA缓冲液处理组织切片。结果表明，高pH值的EDTA缓冲液修复的切片免疫化学染色效果明显优于枸橼酸缓冲液。这或许是因为EDTA缓冲液是一种螯合剂，能够消除由福尔马林固定引起的不利因素。崔锦珠[17]和廖德贵等[18]分别报道高pH值的EDTA缓冲液的效果优于柠檬酸盐缓冲液。Shi等[19]报道了在不同pH值下抗原修复对免疫组化染色结果的影响，他们认为在高pH值下的高温高压抗原修复对于大部分的胞质抗体均能取得良好的效果。因此，高pH值下的高压修复法，具有操作时间短、抗原修复好且结果稳定等优点，目前普遍应用于大多数细胞质抗原的修复中[20]。高温高压EDTA缓冲液抗原修复法可使多数胞质抗体达到理想的染色结果，是一种值得推广使用的免疫组化抗原修复法。

本实验仅在口腔鳞状细胞癌癌旁正常石蜡组织标本中，对SEMA3A和SEMA3B细胞质蛋白通过不同的抗原修复方式及修复液，进行修复实验且比较免疫组化染色结果，而对于其他细胞质蛋白是否也存在与本实验相同的结论，尚有待进一步验证。