李 震，姚弘虞，王世豪，谷晓明，段小飞，孙伟鹏

郑州大学第一附属医院结直肠肛门外科 郑州 450052

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其病理机制涉及多个基因、多种信号通路的调控，治疗多以手术、放化疗和分子靶向治疗为主[1-3]。MAPK信号通路中KRAS基因上游的表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂西妥昔单抗和帕尼单抗，现已成为结直肠癌治疗的一线药物[4-6]。对KRAS基因的进一步研究[7-8]发现，有很大一部分结直肠癌患者存在KRAS基因突变，并且这部分患者对EGFR拮抗剂治疗无效。因此，从KRAS通路下游寻找新的治疗靶点对于KRAS基因突变患者的治疗意义重大。

WNT信号通路的异常表达参与多种肿瘤的发生发展，促进肿瘤细胞的增殖，抑制其凋亡[9-10]。WNT 信号通路中关键的下游分子β-catenin增加会导致Cyclin D1的激活，通过影响细胞分裂周期G1期来抑制凋亡，从而导致肿瘤的发生[11-12]。已有文献[13-14]报道WNT信号通路的激活促进了结直肠癌的发生发展。本研究旨在探索KRAS基因突变的结直肠癌与WNT信号通路之间的相关性。

1 材料与方法

1.1结直肠癌组织标本收集2018年1月至2019年12月在郑州大学第一附属医院结直肠肛门外科住院的206例患者的临床资料及相应的结直肠癌手术标本，包括甲醛固定后的石蜡包埋组织和新鲜组织(置-80 ℃冰箱中保存备用)。利用人类KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)提取石蜡包埋组织DNA，检测 KRAS基因第 2 号外显子的12和13密码子的突变位点。所有患者均无其他合并症且无既往手术史、放化疗史。本研究的开展经郑州大学第一附属医院伦理委员会审查通过(审批号：2020-KY-454)，患者及家属均签署知情同意书。

1.2结直肠癌组织中β-catenin、CyclinD1mRNA相对表达量的qRT-PCR检测新鲜组织用Trizol法提取总RNA后，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，并进行PCR循环扩增。β-catenin上游引物序列： 5’-ATCATCGTGAGGGC TACTG-3’，下游引物序列：5’-CCATCCCTFCCTGTT TAGTT-3’ ；Cyclin D1上游引物序列： 5’-GCT GCGAAGTGGAAACCATC-3’，下游引物序列：5’-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3’；内参GAPDH上游引物序列： 5’-TCTGACTTCAACAGCGACAC-3’，下游引物序列：5’-CAAATTCGTTGTCATACCAG-3’。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 变性15 s,60 ℃退火 60 s，40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达量。

1.3细胞和主要材料人结肠癌细胞SW480(该细胞株KRAS基因的12密码子发生突变[15])购自中国科学院细胞库。RPMI 1640培养基(含双抗)购自北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清和Lipofectamine 2000均购自赛默飞世尔科技有限公司，Trizol 试剂、Annexin-V/PI双染细胞凋亡检测试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix和反转录试剂盒购自康为世纪有限公司，特异性β-catenin siRNA和阴性对照siRNA(si-control)购自上海吉玛制药技术有限公司，MTT购自美国Sigma公司，β-catenin 抗体、Cyclin D1抗体和GAPDH抗体均购自Proteintech公司，细胞裂解液、BCA蛋白浓度试剂盒和ECL化学发光试剂均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4细胞培养及转染SW480细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养。取对数生长期的细胞接种于96孔板，培养至细胞融合度达到80%后，用Lipofectamine 2000转染β-catenin siRNA(β-catenin siRNA组)或si-control(阴性对照组)，以不转染细胞作为空白对照组。β-catenin siRNA序列：正义链5’-CCCACTAATGTCCAGCGTT-3’；反义链5’-CGCTGGACATTAGTGGGTT-3’；si-control siRNA 序列：正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；反义链 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.5 3组细胞中β-catenin、CyclinD1蛋白表达的Westernblot检测细胞转染48 h后收集并裂解，提取总蛋白并利用BCA法进行蛋白定量。按照试剂盒操作要求进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至硝酸纤维素滤膜上，50 g/L脱脂牛奶液封闭1 h，分别加入β-catenin、Cyclin D1抗体(均按1∶1 000稀释)和GAPDH抗体(按1∶5 000稀释)4 ℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(按1∶10 000稀释)，ECL显色，用凝胶成像系统进行曝光扫描，Image J软件分析目的条带灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值。实验重复3次。

1.6 3组细胞增殖的MTT法检测将按1.4项分组处理后的细胞培养24、48、72和96 h后，每孔加入10 μL MTT(5 g/L)继续孵育2 h，弃掉上清液，加入150 μL DMSO， 用酶标仪检测570 nm波长的吸光度(A)值。实验重复3次。

1.7 3组细胞凋亡率的检测细胞分组处理48 h后收集细胞，按照Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒说明操作。PBS清洗2次，加入100 μL 的 Loading Buffer混悬细胞后加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，避光孵育15 min，在流式细胞仪中检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 20.0 进行分析，应用χ2检验比较KRAS基因突变率在不同年龄段、性别、肿瘤部位、分化程度的结直肠癌组织的差异，应用两独立样本t检验比较KRAS基因野生型和突变型结直肠癌组织中β-catenin和 Cyclin D1 mRNA表达水平的差异，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较3组细胞中β-catenin和 Cyclin D1蛋白表达、细胞增殖能力和凋亡率的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1KRAS基因突变与结直肠癌临床病理特征相关性分析206例结直肠癌患者标本中，78例为KRAS基因突变型，128例为野生型，突变率为37.8%。KRAS基因突变率与患者性别、年龄、肿瘤部位和分化程度等均无关(表1)。

表1 不同临床病理特征结直肠癌组织中KRAS基因突变的比较

2.2KRAS基因野生型和突变型结直肠癌组织中β-catenin和CyclinD1mRNA表达水平的比较见表2。

表2 KRAS基因野生型和突变型结直肠癌组织中β-catenin和 Cyclin D1 mRNA表达水平的比较

2.3 3组细胞中β-catenin和CyclinD1蛋白表达的比较水平见表3。

表3 3组细胞中β-catenin和Cyclin D1蛋白表达水平的比较

2.4 3组细胞增殖和凋亡的比较3组细胞A值的比较见表4。由表4可知，转染组细胞在24、48、72及96 h的增殖能力均低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.001)。空白对照组[(10.3±4.9)%]、阴性对照组[(9.9±4.6)%]和β-catenin siRNA组[(24.3±4.8)%]细胞凋亡率比较差异有统计学意义(F=8.939，P=0.016)，β-catenin siRNA组细胞凋亡率高于空白对照组(P<0.05)。

表4 3组细胞A值的比较

3 讨论

结直肠癌是世界上病发率和致死率都很高的疾病之一，靶向药物EGFR拮抗剂的使用让结直肠癌患者获益良多[16-18]。但是此药物只对KRAS基因野生型的患者有效，对于KRAS基因突变的患者无效[19-21]。相关研究结果提示，KRAS 基因突变可能与结直肠癌的恶性进展有关[22]，且与肿瘤的多发转移有密切关联[23]。对于KRAS基因突变型结直肠癌患者，寻找WNT信号通路中的分子靶点可为结直肠癌临床靶向治疗提供一个新的切入点。

WNT信号通路涉及多种肿瘤的发生发展，例如肝癌、乳腺癌、胃癌等[22-27]。已有研究[28]报道在结直肠癌中KRAS/BRAF/MEK信号的激活刺激WNT/β-catenin通路，进而促进了肠道肿瘤的生长和侵袭，但是其具体机制尚不是很清楚。本研究发现在结直肠癌标本中KRAS基因突变型占37.8%，且与结直肠癌临床病理特征无明显相关性。在KRAS基因突变型的结直肠癌标本中发现WNT信号通道相关蛋白β-catenin 和Cyclin D1 mRNA的表达水平比在KRAS基因野生型的标本中高，差异有统计学意义。

为了进一步了解KRAS基因突变与WNT信号通路的关系，在KRAS基因突变型的结直肠癌细胞SW480中，利用基因干扰技术将WNT信号通道相关蛋白β-catenin基因干扰后使其表达降低，探索细胞增殖和凋亡情况，发现β-catenin基因干扰后细胞增殖能力下降，并促进了细胞的凋亡。以上这些实验结果表明KRAS基因突变型的结直肠癌可能通过抑制WNT信号通道相关蛋白来影响结直肠癌的发生发展。

综上，干扰WNT信号通道相关蛋白β-catenin基因有可能为KRAS基因突变型结直肠癌患者的临床靶向治疗提供一个研究思路，但具体的分子机制仍需进一步的研究探讨。