陈秀 陈甘潇 张中和 胡丹 夏豪

(武汉大学人民医院心血管内科 武汉大学心血管病研究所 湖北省心脏重点实验室，湖北 武汉 430060)

早期复极模式(early repolarization pattern，ERP)是指除外V1～V3导联，12导联心电图上≥2个相邻导联出现J波(QRS波群终末切迹或顿挫)顶点(Jp)振幅≥0.1mV，QRS波群时限(在无切迹或顿挫的导联上)<120 ms，伴或不伴ST段抬高。过去几十年一直被认为是一种良性心电图改变[1-2]。直到2000年，Gussak等[3]通过建立犬心室的楔形组织模型提出，这种“良性表现”有发展为多形性室性心动过速(室速)甚至心室颤动(室颤)的倾向。8年后，Haïssaguerre等通过多个临床研究证实了这一假说[4-6]。随后大量流行病学调查研究也发现，ERP(尤其是位于下/侧壁)会增加恶性心律失常事件和心源性猝死的风险[7-8]。心电图下壁和/或侧壁导联记录到ERP，并伴有心搏骤停幸存史或室速/室颤史的患者即可被诊断为早期复极综合征(early repolarization syndrome，ERS)。ERS具有明显的家族遗传倾向，目前已发现的与ERS有关的离子通道异常基因有：KCNJ8、CACNA1C、CACNB2b、CACNA2D1、ABCC9、SCN5A、SCN10A和KCND3[9-15]。但目前仅对一小部分已识别的突变进行了功能表达的研究，确定了这些突变与ERS的因果关系及较为合理的致病机制。本研究利用二代测序技术、全细胞膜片钳、共聚焦荧光显微镜等实验技术，探究CACNA1C-P817S突变与ERS的因果关系及其可能的致病机制。

1 材料和方法

1.1 病例收集与遗传学分析

本研究遵循赫尔辛基宣言和本单位伦理学规章制度，患者签署知情同意书。收集就诊于武汉大学人民医院心血管内科的ERS患者，入选标准：心电图下壁和/或侧壁导联记录到ERP，并伴有心搏骤停幸存史或室速/室颤史者；ERP：除外V1～V3导联，12导联心电图上≥2个相邻导联出现J波(QRS波群终末切迹或顿挫)顶点(Jp)振幅≥0.1 mV，QRS波群时限(在无切迹或顿挫的导联上)<120 ms，伴或不伴ST段抬高[1-2]。排除标准：所有患者需排除ST段抬高心肌梗死、心室动脉瘤、心包疾病、电解质紊乱(高钾和低钙等)、体温过低、致心律失常型右心室心肌病等其他原因导致的ST段异常抬高。临床评估包括：病史、详细的体格检查、血液检查、心电图、超声心动图和冠状动脉造影。收集其外周血样本，从外周血白细胞中提取DNA，采用二代测序技术，对常见致心肌早期复极的候选基因(KCNJ8、CACNA1C、CACNB2b、CACNA2D1、ABCC9、SCN5A、SCN10A和KCND3)进行测序。这些候选基因的确定是基于既往报道的致ERS的突变基因。PCR扩增候选基因的外显子及外显子与内含子的接头序列，将纯化的PCR产物于ABI 3730遗传分析仪(Applied Biosystem，美国)上进行循环测序，测序结果由Mutation Surveyor V4.0.8软件(Softgenetics，美国)进行分析，并重复以上程序再次确认。被认为具有致病性的新突变为：(1)终止/移码突变；(2)错义突变位于物种间氨基酸保守区域；(3)符合GT-AT法则的剪切位点突变；(4)对照人群中最小等位基因频率(MAF)<0.005；和/或(5)通过PolyPhen-2和MetaLR软件预测可能有害或致病的突变。

1.2 HEK细胞的转染

将野生型(WT)和携带突变的CACNA1C全长cDNA序列克隆于带有增强型黄色荧光蛋白(EYFP)的pcDNA3.1载体，构建相应质粒。同时将WT-CACNB2b和CACNA2D1全长cDNA序列克隆于pcDNA3.1载体，构建WT-CACNB2b和WT-CACNA2D1质粒。将3种质粒按1∶1∶1的比例，按照Lipofectamine 2000说明书用Lipofectamine 2000转染试剂(Life Technologies，美国)共转染入人胚肾293(HEK293)细胞(中科院上海细胞库，中国)。

1.3 细胞电生理检测

选取转染后48～72 h，在倒置荧光显微镜(IX70，Olympus，日本)下观察，为单个独立、表面光滑、形态良好且贴壁牢固的带有黄色荧光的细胞，置于配置好的细胞外液中(MgCl21 mmol/L、CaCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、TEA 150 mmol/L，CsOH调节pH至7.35)。全细胞膜片钳系统使用AXON-700B膜片钳放大器(Axon Instruments，美国)来记录ICa，全过程在室温(20～23 ℃)下进行。连接膜片钳放大器与计算机，由pCLAMP 10.4软件(Axon Instruments，美国)控制，Digidata 1440A数模转换器(Axon Instruments，美国)采集信号。玻璃微电极充灌电极内液后(CsCl 110 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Mg-ATP 2 mmol/L、TEA 10 mmol/L，CsOH调节pH至7.35)，对选取的细胞进行负压封接和破膜，形成全细胞记录模式，记录ICa。……