李晓，郭艳丽，韩俊婷，邹晓萍，董渠龙

大气颗粒物中空气动力学直径≤2.5 μm的细颗粒物（fine particulate matter，PM2.5）是环境污染物之一，其特点为粒径小、面积大、活性强和成分复杂，不仅能吸附多种有机碳、硝酸盐、硫酸盐和重金属等有毒有害物质，且能在大气中长时间停留、输送距离远，因此对人体健康存在巨大的威胁，已成为近年研究的热点问题[1-2]。

过去关于PM2.5对于人类健康的危害多聚焦于呼吸系统[3-4]、心血管系统[5-6]、癌症[7]、免疫系统[8]及神经系统[9]，其对于人类生殖健康危害的研究虽也有所报道，但相对较少且研究并不深入，仍在不断地探索中。国内一项共纳入426 246名初产妇的研究表明，空气中PM2.5浓度每增加10 μg/m3，孕早期发生流产的风险增加到1.04倍，孕中期发生流产的风险增加到1.02倍，孕晚期发生早产的风险增加到1.06倍[10]。另有国内外文献报道，PM2.5是新生儿低出生体质量、早产、胎儿生长受限、妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病和出生缺陷等不良妊娠结局的危险因素[11-12]，但其潜在机制尚不明确。本课题组前期实验已证实PM2.5在体外可抑制人类胎盘滋养细胞增殖、降低其迁移与侵袭力[13-14]，而滋养细胞的正常增殖及功能受到侵扰则已公认与流产、早产、胎盘功能不良、胎儿生长受限、妊娠期高血压疾病等不良妊娠结局有关，找到一种对抗PM2.5抑制滋养细胞增殖及功能的药物可能对保护人类生育力具有重要意义。

传统中药五子衍宗丸可以促进人类生育力，五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是其君药五味子的主要成份。研究表明，Sch B可以降低氧化应激反应并抑制细胞的凋亡[15]。本课题组前期的研究也表明Sch B可以有效降低环境污染物苯并（a）芘对人早孕胎盘绒毛膜外滋养层（human trophoblast HTR-8/SVneo，HTR）细胞的毒性作用[16]。本实验旨在探讨Sch B是否可以降低PM2.5对HTR细胞增殖的抑制作用，这对于阐明Sch B是否具有预防或治疗PM2.5引起的生殖毒性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料HTR细胞株由加拿大Graham教授惠赠，PM2.5（中国药品生物制品检定所），Sch B（中国药品生物制品检定所），RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司），小牛血清（美国GIBCO公司），胰蛋白酶（北京索莱宝生物科技公司），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，美国Sigma公司），MTS细胞增殖检测试剂盒（Promega北京生物技术有限公司），细胞培养箱（美国Thermo公司），倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），无菌超净工作台（苏州安泰空气技术公司），移液器（德国Eppendorf公司），酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 细胞培养HTR细胞接种于规格为10 cm的细胞培养皿中，给予RPMI-1640完全培养基7 mL后置于37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱中常规培养。根据细胞生长情况适时进行换液、传代、冻存及MTS细胞增殖实验。

1.3 MTS细胞增殖实验

1.3.1 MTS细胞增殖实验检测PM2.5对HTR细胞的增殖效应收集消化的HTR细胞制成单细胞悬浮溶液，将HTR细胞接种于96孔板中（每孔接种10 000个细胞），于37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养24 h后将RPMI-1640完全培养基更替为不同浓度的PM2.5溶液进行加药处理，同时以0.05%DMSO溶液作为对照组，每组5个孔。继续培养36 h后，利用酶标仪在492 nm波长处测出每孔的OD值。

1.3.2 MTS细胞增殖实验检测Sch B对HTR细胞的增殖效应实验方法与1.3.1中方法一致，不同之处在于加药组为不同浓度的Sch B溶液。

1.3.3 MTS细胞增殖实验检测Sch B+PM2.5给药对HTR细胞的增殖效应 实验方法与1.3.1中方法一致，不同之处在于加药组为不同浓度的Sch B+150 μg/mL浓度的PM2.5（后续表述为不同浓度的Sch B+PM2.5给药组）。

1.4 结果计算对各组所测OD值进行计算，分析出PM2.5对HTR细胞的抑制率和Sch B的保护率。计算公式如下：

抑制率（%）=（对照组平均OD值－实验组平均OD值）/对照组平均OD值×100%

保护率（%）=（实验组平均OD值－对照组平均OD值）/对照组平均OD值×100%

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件包进行统计学分析。定量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析方法，组间比较采用LSD法进行检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同浓度PM2.5对HTR细胞增殖的影响利用MTS实验探索0.01～1 000 μg/mL范围内不同浓度的PM2.5作用于HTR细胞36 h后的细胞增殖情况，其中0.05% DMSO及0.01、0.1、1 μg/mL浓度的PM2.5对HTR细胞的增殖影响与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而10、100、500、1 000 μg/mL浓度的PM2.5与对照组相比均抑制了HTR细胞的增殖，差异有统计学意义（P＜0.01），其细胞增殖率分别是对照组的97.87%、90.20%、44.32%和24.45%。见图1。

图1 不同浓度PM2.5对HTR细胞增殖的影响

2.2不同浓度PM2.5对HTR细胞作用不同时间的影响根据图1可以确定PM2.5在100～500 μg/mL范围内存在一个最佳染毒剂量利于后续研究Sch B的作用，故在该浓度范围内进一步探索不同梯度浓度的PM2.5对HTR细胞作用不同时间的增殖影响。利用100、150、200、250、300、400、500 μg/mL的PM2.5对HTR细胞作用6、12、24、36、48 h后进行MTS细胞增殖实验，绘成细胞生长曲线，见图2。从图2中可以看出，在此浓度范围内，随着PM2.5浓度地不断增加，各时间点的HTR细胞增殖均受到了不同程度的抑制，且抑制率不仅随着PM2.5浓度地增加而增大，也随着作用时间延长而增大，但从时间上面看，作用36 h后抑制效率趋于饱和，进一步延长作用时间并未明显增加PM2.5的抑制率。100、150、200、250、300、400、500 μg/mL的PM2.5对HTR细胞作用36 h后其细胞增殖率分别是对照组的88.75%、78.03%、65.84%、56.24%、50.06%、44.54%、40.06%。根据其抑制率，最终选择150 μg/mL浓度的PM2.5进行后续研究。

图2 HTR细胞在各浓度PM2.5作用不同时间下的生长曲线

2.3不同浓度Sch B对HTR细胞增殖的影响利用MTS实验探索0.01～1 000 μmol/L范围内不同浓度的Sch B作用HTR细胞36 h后的细胞增殖情况，0.01、0.1、1、10、100、500、1 000 μmol/L浓度的Sch B作用后其细胞增殖率分别是对照组的99.74%、99.80%、101.00%、97.26%、89.01%、84.32%、80.41%。其中，0.01、0.1、1 μmol/L浓度的Sch B与对照组相比，增殖率差异无统计学意义（P＞0.05），而10、100、500、1 000 μmol/L浓度的Sch B组细胞增殖率与对照组相比均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图3 不同浓度Sch B对HTR细胞增殖的影响

取0.1～10 μmol/L浓度范围的Sch B作用HTR细胞36 h后的细胞增殖情况如图4所示，0.1、0.25、0.5 μmol/L浓度的Sch B对HTR细胞的增殖率分别为对照组的99.80%、100.20%、100.59%，与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；1、2 μmol/L浓度的Sch B的细胞增殖率分别为对照组的101.00%、102.37%，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；5、10 μmol/L浓度的Sch B组其细胞增殖率分别为对照组的100.90%、97.26%，前者与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），后者与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图4 进一步探索Sch B对HTR细胞增殖的影响

2.4 Sch B降低了PM2.5对HTR细胞增殖的抑制作用如图5所示，0.1～10 μmol/L范围内不同浓度的Sch B和150 μg/mL浓度的PM2.5联合给药作用HTR细胞36 h后，各组的细胞增殖率分别为对照组的78.03%、79.36%、80.17%、84.20%、86.07%、89.01%、81.72%、74.43%，与对照组相比，各组的细胞增殖均受到了不同程度的抑制，差异有统计学意义（P＜0.01）；但是与150 μg/mL PM2.5单独给药组（简称PM2.5单独给药组）相比，浓度为0.25、0.5、1、2、5 μmol/L的Sch B+PM2.5给药组则促进了HTR细胞的增殖，差异有统计学意义（P＜0.01），浓度为10 μmol/L的Sch B+PM2.5给药组则进一步抑制了HTR细胞的增殖，差异有统计学意义（P＜0.01）。而0.1 μmol/L的Sch B+PM2.5给药组与PM2.5单独给药组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步分析各浓度Sch B降低PM2.5对HTR细胞的抑制效率如图6所示，与单独PM2.5给药组相比，0.1、0.25、0.5、1、2、5 μmol/L的Sch B+PM2.5给药组的细胞保护率分别为1.70%、2.74%、7.90%、10.30%、14.07%、4.73%；10 μmol/L的Sch B+PM2.5给药组的细胞增殖率为PM2.5单独给药组的95.39%。

图5 各浓度Sch B联合PM2.5给药对HTR细胞增殖的影响

图6 各浓度Sch B联合PM2.5给药与PM2.5单独给药的对比

3 讨论

受精卵早在发育到囊胚时已分化出滋养细胞，而滋养细胞具有侵蚀性，对于受精卵的着床、胚胎植入、胎盘形成及母血交换等过程至关重要，其功能的异常往往引起流产、胚胎停育、早产、妊娠期高血压疾病等不良妊娠结局，故有学者认为其是维持胚胎生长发育的核心单元[17-18]。本研究直接以HTR细胞为研究对象，对于阐释环境污染物PM2.5的生殖毒性具有直观可靠的优势。

本研究利用MTS细胞增殖实验检测PM2.5在体外对HTR细胞增殖的影响，结果发现0.05%DMSO及0.01、0.1、1 μg/mL浓度的PM2.5不影响HTR细胞的增殖，差异无统计学意义（P＞0.05），但10、100、500、1 000 μg/mL浓度的PM2.5均不同程度抑制了HTR细胞的增殖（P＜0.01），这说明溶解PM2.5的溶剂0.05%DMSO本身并不抑制细胞增殖，但PM2.5浓度达到一定的水平则会抑制HTR细胞的增殖，即可造成细胞毒性。为了寻找PM2.5的最佳毒性作用以利于后续研究，本研究将PM2.5浓度细分为100、150、200、250、300、400、500 μg/mL七个浓度梯度，并均对HTR细胞进行6、12、24、36、48 h的染毒，以观察HTR细胞在不同浓度梯度的PM2.5不同作用时间下的细胞增殖情况，发现100～500 μg/mL浓度范围内的PM2.5在各个时间点对HTR细胞均有抑制作用，其抑制作用在该浓度范围内随着PM2.5浓度的增加而增加，也随着作用时间的延长而增加，但作用36 h后抑制作用趋于饱和。通过分析发现150 μg/mL浓度的PM2.5作用HTR 细胞36 h 后细胞增殖率为对照组的78.03%，这个抑制率较为理想，适合后续研究，故后续实验中以此浓度进行HTR细胞的染毒。这再次明确了PM2.5对HTR细胞的体外直接毒性作用。

本研究还利用MTS细胞增殖实验验证Sch B本身对HTR细胞是否具有毒性作用，结果显示，0.01～1 μmol/L浓度的Sch B并未抑制HTR细胞的增殖，0.25、0.5、1、2、5 μmol/L浓度的Sch B对HTR细胞还有轻微的促增殖作用，且在0.25～2 μmol/L浓度范围内其促增殖作用随着剂量增加而轻微增加，但是10、100、500、1 000 μmol/L浓度的Sch B则均抑制了HTR细胞的增殖，即产生了细胞毒性，这说明适量浓度范围内的Sch B（≤5 μmol/L）本身不会对HTR细胞增殖产生抑制作用，反而0.25～5 μmol/L浓度范围内可以促HTR细胞增殖。之后将0.1～10 μmol/L浓度Sch B与150 μg/mL浓度的PM2.5共同培养36 h。结果发现，与对照组相比，虽然各组的增殖均受到不同程度的抑制，但是与单独150 μg/mL PM2.5给药组相比，0.1、0.25、0.5、1、2、5 μmol/L的Sch B+PM2.5给药组则促进了HTR细胞的增殖，即降低了PM2.5的抑制作用，且在0.1～2 μmol/L浓度范围内其降低PM2.5抑制HTR细胞增殖作用随着剂量增加而增加。但需注意10 μmol/L的Sch B+PM2.5给药组则增强了PM2.5的抑制HTR增殖作用，这可能与10 μmol/L的Sch B本身就具有细胞增殖抑制作用有关。进一步的分析发现，0.1、0.25、0.5、1、2、5 μmol/L的Sch B+PM2.5给药组的细胞保护率分别为1.70%、2.74%、7.90%、10.30%、14.07%、4.73%，保护效果明确有效。

需要说明的是，据文献报道，目前我国污染最严重的中东部城区环境监测站实测PM2.5浓度可高达500～700 μg/m3，远高于世界卫生组织的标准[19]，但是与本研究的有效浓度差距仍然较大，这并不能说明目前我国污染严重的地区不会带来人类生殖毒性，原因在于本研究主要为体外实验，需要在短时间内观察细胞的增殖变化，故PM2.5的作用浓度会大大增加，而环境中PM2.5则会长期存在，即使小剂量也会对人体起到“潜移默化”的影响，所以这也是本研究的不足之处，即虽然证实了PM2.5对HTR的毒性，但并不能仅利用HTR细胞的体外试验就充分说明PM2.5的生殖毒性，还需要体内试验的充分佐证。

此外，本研究利用体外实验还证实了Sch B可以降低PM2.5对HTR细胞增殖的抑制作用，这与已有的研究证实Sch B作为抗氧化应激、抗凋亡信号通路的激动剂在保护HTR细胞遭受的环境污染物苯并（a）芘毒性相一致[20-21]，这为降低PM2.5的毒性从而保护滋养细胞的生殖健康提供了新的用药思路，但Sch B实现这一保护人类生殖健康的潜在分子机制以及信号通路尚不明确，本课题组仍在探索中，也希望可以进一步开发出相关药物保护和促进人类生殖健康。