贾立云，封纪珍，王熙，马翠霞，封露露

Citrin蛋白缺乏症是一类常染色体隐性遗传病，由SLC25A13基因突变所致，引起肝细胞线粒体Citrin蛋白功能不足，导致机体代谢紊乱[1]。该病临床罕见，发病机制目前尚不完全清楚，临床上将其分为两类：一类为新生儿肝内胆汁淤积症（neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency，NICCD），由Citrin蛋白缺乏所致；另一类为成年发作Ⅱ型瓜氨酸血症（citrullinaemia type Ⅱ，CILN2）[2]。Citrin蛋白缺陷所致的NICCD最常见，新生儿期主要表现为胆汁淤积、黄疸延迟消退、凝血功能障碍、肝功能异常以及血氨基酸水平升高。NICCD患儿预后较好，多数患儿1岁以内可恢复正常，少数患儿因延迟就医而发生肝功能衰竭[3-5]。自2013年串联质谱技术不断在新生儿遗传代谢病筛查中推广应用，使患儿得以早发现、早诊断和早治疗，我国部分地区已经将NICCD列为筛查病种之一，然而此病部分患儿呈现假阴性[6-7]。本研究采用串联质谱技术对石家庄地区2014—2019年出生的160 061例活产新生儿进行氨基酸水平检测，初步明确了该病在石家庄地区的患病率，进而对部分患儿进行基因检测，发现了1种未报道过的SLC25A13基因突变位点。

1 资料与方法

1.1一般资料采集石家庄地区2014年1月—2019年12月分娩的160 061例活产新生儿（3～20 d） 的足跟血，制成S&S903滤纸干血斑标本，经石家庄市新生儿疾病筛查中心串联质谱筛查并进一步确诊的1例Citrin蛋白缺乏症患儿以及1例假阴性患儿。筛查前家长均签署知情同意书，本研究经石家庄市妇幼保健院伦理委员会批准实施。

1.2检测方法

1.2.1 仪器与试剂 串联质谱仪（TQD，Waters）、自动进样器（2777C）、高效液相色谱仪泵（1525）、串联质谱筛查数据分析软件（MassLynxV4.1）均购自美国Waters公司；超声波清洗机购自中国康士洁有限公司；通风柜购自中国杰瑞电气有限公司；微孔板恒温孵育震荡仪购自杭州奥盛仪器有限公司；串联质谱-非衍生化氨基酸测定试剂盒购自山东英盛公司。

1.2.2 标本采集 生后72 h，充分哺乳后于新生儿足跟内、外侧缘用75%的乙醇棉签消毒后，采用触压式采血器穿刺，深度不超过2.0 mm，用无菌棉球弃去第一滴血，连续采集3个血滴于S&S903滤纸，每个血斑的直径不小于8 mm，以水平位置悬挂血片，室温下自然干燥2～3 h后，血斑颜色从鲜红至褐色即可递送，如不能当日进行递送，应将血片标本置于密封袋中，置于2～8 ℃冰箱，最迟不超过5个工作日递送至筛查中心。

1.2.3 检测方法 采用串联质谱干血滤纸片——非衍生法。①萃取：用打孔器从标本上打出直径3 mm的血斑，置于96孔微孔板中。使用校准的移液器，将90 μL萃取工作液依次加入到标本孔中，贴上封片以减少蒸发，30 ℃，700 r/min，于恒温震荡孵育器震荡45 min。②上机：取出96孔板，移液75 μL至V型底96孔板，铝箔纸覆上，减少挥发，置于2777C自动进样器中；MassLynxV4.1中建立样品列表，冲洗管路后进样分析。③浓度值计算：通过比较分析物及内标的信号积分面积，计算待检物质的浓度水平。

1.2.4 质量控制 每批实验均设置高、低质控，质控来源为山东英盛氨基酸和肉碱测定试剂盒自带商品化高、低质控。每次检测过程中将室内质控品与样本同时检测，记录此标本的检测结果；计算前20次检测结果的平均值作为本批质控品的靶值，质控结果控制在靶值±2SD内；每年参加2次国家卫生健康委员会临床检验中心的室间质量评价，成绩合格。

1.2.5 诊断方法

1.2.5.1 确诊 串联质谱筛查血瓜氨酸水平≥30 μmol/L为筛查阳性，召回复查阳性患儿进行生化检测，显示总蛋白、白蛋白明显降低；碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶、胆汁酸、总胆红素、直接胆红素升高；甲胎蛋白＞1 000 μg/L；尿有机酸水平显著升高。肝性和胆汁淤积性黄疸，直接胆红素、血瓜氨酸升高为主要临床特征。以SLC25A13基因检测到突变为基因确诊。

1.2.5.2 基因检测 疑似患儿经知情同意，采集患儿及父母外周静脉血各4 mL，采用DNA提取试剂盒（Qiagen）提取核酸，后进行基因组文库构建。用标记的探针抓取目的基因，用磁力架吸附，富集目的基因。采用Illumina公司的NextSeq 500进行代谢相关基因测序[8]。检测到的变异位点严格按照ACMG指南进行致病性分析。未报道的基因突变，则用生物信息学蛋白功能预测软件预测致病性，进一步采用Sanger测序进行结果验证。此检测由北京迈基诺医学检验所完成。

2 结果

2.1总体筛查情况160 061例新生儿中筛查阳性20例，确诊1例，另1例患儿筛查未能检出，呈现假阴性，患儿不足1个月因皮肤黄染加重入院，查血串联质谱，显示瓜氨酸和甲硫氨酸升高；Citrin蛋白缺乏症在石家庄地区新生儿中的患病率为2/160 061。

2.2串联质谱筛查结果2例Citrin蛋白缺乏症患儿中，例1初筛结果瓜氨酸（CIT）水平稍高于参考值范围（4～30 μmol/L），为44.00 μmol/L，复查时CIT为504.00 μmol/L，甲硫氨酸（MET）58.60 μmol/L（参考值8～50 μmol/L）；例2初筛结果CIT在正常参考范围以内，为17.17 μmol/L，未做复查。

2.3基因突变检测结果2例患儿中只有1例患儿进行基因检测，检测结果发现为SLC25A13基因复合杂合突变，见图1，分别来自父母，其中c.1021+1G＞A为剪切位点突变，为未见报道突变，使用GERP++、SIFT、REVEL、PolyPhen_2、MutationTaster等生物信息学蛋白功能预测软件，预测其致病性，结合患儿皮肤黄染加重，血串联质谱显示瓜氨酸和甲硫氨酸升高，尿有机酸气相质谱显示4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸均显著升高，考虑为致病性变异；c.851_854delTATG为缺失突变，造成移码突变，编码2个氨基酸后终止，见表1。

图1 例1患儿的SLC25A13基因突变检测结果

表1 Citrin蛋白缺乏症患儿基因突变检测结果

3 讨论

3.1 Citrin蛋白缺乏症在石家庄地区新生儿中的患病率Citrin蛋白缺乏致NICCD是尿素循环障碍旁路代谢异常疾病，在新生儿期主要有黄疸消退减慢、胆汁淤积等临床表现，如未能明确病因，会延误诊治，影响患儿预后[9]。串联质谱技术在新生儿疾病筛查中的不断推广应用，使早期发病的Citrin蛋白缺乏症患儿得以筛查、确诊和及时干预治疗[10-11]。据文献报道，该病在韩国的患病率为1/50 000，日本为1/19 000，我国的患病率为1/17 000[12]。文献报道该病在广州市新生儿中患病率为1/22 664[6]。本研究采用串联质谱技术对160 061例新生儿进行筛查，回顾分析发现Citrin蛋白缺乏症在石家庄地区新生儿中的患病率为2/160 061，低于广州市新生儿患病率，可能与南北地区人群的SLC25A13基因突变杂合子携带率不同相关，具有地域性差异，有待进一步分析。

3.2 部分Citrin蛋白缺乏症筛查呈假阴性本研究检出1例患儿，串联质谱筛查和瓜氨酸增高对明确诊断NICCD有重要意义。此外筛查发现1例呈假阴性，据文献报道广州市158 651例新生儿中发现4例患儿呈假阴性[6]。因此，新生儿筛查只能筛查部分Citrin蛋白缺乏症患儿，因患儿在新生儿早期可出现不同程度的血氨基酸改变[13]，可能与采血时间偏早，代谢谱特征尚未呈现有关，有待于进一步研究。

3.3 SLC25A13基因突变分析Citrin蛋白缺乏症是一类常染色体隐性遗传病，定位于7q21.3，由SLC25A13基因突变所致[14]。已报道54种突变，其中与临床表现密切相关的有10 个，分别为c.851_854delTATG、c.615+5G＞A、g.IVS16ins3kb、c.1638_1660dup23、c.955C＞T、c.1592G＞A、c.1399C＞T、IVS11+1G＞A、c.1092_1095delT、c.754G＞A，尤其是c.851_854delTATG、c.615+5G＞A、c.1638-1660dup23和g.IVS16ins3kb，这4个突变位点在中国人群中占所有突变的90%以上[15-19]。本研究发现的1例患儿为复合杂合突变，突变位点分别为c.1021+1G＞A、c.851_854delTATG，其中c.1021+1G＞A为未报到基因突变。

Citrin蛋白缺乏症作为常见的代谢性疾病，是一种潜在的致死性疾病，早期诊断、早期治疗是本病诊疗的关键。本研究应用串联质谱技术进行筛查，初步明确了该病在石家庄地区新生儿中的患病率；进一步结合基因检测技术手段明确致病基因突变类型，为家庭再生育前的遗传咨询给予指导。