王本鑫，王福义，孟凡鑫

沈阳医学院附属中心医院检验科，辽宁沈阳 110024

丙型肝炎病毒(HCV)感染已经成为严重的公共卫生问题[1]。HCV感染在大多数感染者中为慢性感染，是肝细胞癌的主要原因之一[2]。HCV感染发生在肝细胞内，因此HCV的免疫防御第一线依赖于肝细胞的内在先天免疫[3]。干扰素(IFN)的表达驱动数百种干扰素刺激基因(ISG)的表达，这些ISG编码先天的免疫效应子，这些效应子也控制着病毒的复制和传播[4]。影响HCV感染的基因包括不同的IRF家族成员、信号转导因子和其他未知作用机制的ISG，例如ADAR1[5]。已有研究表明，ADAR1能够帮助HCV逃避宿主的先天免疫[6]，但是其中的机制尚不明确。基于此，本研究旨在探讨HCV调控ADAR1逃避先天免疫的潜在机制。

1 材料与方法

1.1细胞来源及主要试剂 Huh7细胞购自深圳市益百顺科技有限公司(货号：Huh-7)。引物和DNA探针购自Life Technologies公司。miRNA mimics,miRNA inhibitor、siRNA均由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。DMEM培养基购自深圳市益百顺科技有限公司(货号：XBPY)。HCV Jc1病毒受赠于武汉病毒所。QuickextractTMRNA提取试剂盒购自蓝景科信(北京)技术有限公司(货号：QER090150)。DNaseI购自北京普益华科技有限公司(货号：AMPD1-1KT)。PrimeScript RT预混液购自Takara公司(货号：RR036Q)。NucleoSpin RNAⅡ试剂盒购自Gene公司(货号：740945.50)。ADAR1的3′端非编码区由Huh7细胞基因组扩增并插入pMIR载体中构成，并命名为ADAR1-3′UTR-WT。ADAR1-3′UTR-MT为ADAR1的3′端非编码区中miRNA靶向区域的碱基突变形式。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 Huh7细胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，并补充葡萄糖(4.5 g/L)、2 mmol/L 1-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠和1X MEM非必需氨基酸，将细胞放于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。将miRNA mimics、miRNA inhibitor、siRNA与Lipofectamine 2000试剂混合，终浓度为100 nmol/L，静置20 min。然后，将复合物与2×105个细胞混合，并在不存在血清的情况下使用OPTIMEM培养基接种到24孔板中。……