朱晓燕，姚冬颖，郭 军，郭 治，杨 华，靳 毅

河北省邢台市人民医院：1.肿瘤内二科；2.病理科，河北邢台 054000

胃癌是最为常见的一种恶性消化道肿瘤，其病死率居所有恶性肿瘤的第2位[1]。近年来，随着我国人口老龄化，人们生活环境和饮食习惯的改变，胃癌的发病率也呈现出逐年升高的趋势。我国大多数胃癌患者就诊时已处于进展期或晚期，治疗难度大，预后差，总体生存时间较短，术后的复发和转移成为导致患者死亡最主要的原因[2]。研究显示，影响胃癌预后的因素众多，包括肿瘤发生部位、组织学类型、TNM分期、分化程度、浸润深度、手术根治类型、转移及放化疗等辅助治疗方式等[3]，而这些因素都有多种基因的参与和调节。因此，探索有效的早期诊断和预后评价的检测指标对改善胃癌患者预后有重要意义。胃癌的发生和进展是一个涉及多种原癌基因激活和抑癌基因失活的渐进过程。p53基因是目前研究最为广泛的一种与人类肿瘤相关的抑癌基因，其突变产物是肿瘤促进因子，有致癌作用[4]。microRNA(miRNA)是真核生物中的一类非编码单链RNA分子，也是近年来发现的基因表达调节工具，通过参与转录后靶基因表达的调控来调节细胞增殖、凋亡、分化等过程。有研究显示，miRNA与癌症的发生、发展密切相关，在特定情况下可扮演癌基因或抑癌基因的角色[5]。miRNA-92a(miR-92a)属于miRNA-17-92家族，其在肿瘤发生、发展过程中多发挥癌基因的作用[6]。人浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1 )是近年来新发现的一种长链非编码RNA(lncRNA)，其在胃癌组织中呈现高表达，而且其表达水平与患者的临床病理特征有明显相关性[7]。虽然胃癌组织中p53、PVT1基因和miR-92a表达情况及其与患者病理特征之间的关系已有研究，但评估三者血清水平在胃癌预后中的价值研究很少。本研究旨在探讨血清抑癌基因p53、PVT1和miR-92a检测在胃癌患者预后评估中的价值，以期为患者的预后评估和临床治疗方案的选择提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年1月至2017年7月在本院接受治疗的148例行胃癌根治术的胃癌患者和136例慢性萎缩性胃炎患者分别作为胃癌组、良性病变组。纳入标准：(1)患者均表现出不同程度的腹胀、腹痛、恶心、嗳气、反酸、呕吐、消瘦等症状；(2)有完整的病历和随访资料；(3)经胃镜检查或病理学检查确诊。排除标准：(1)既往有胃手术史；(2)长期酗酒；(3)患有免疫系统、血液系统、内分泌系统疾病，或患有影响肿瘤标志物检测的相关疾病；(4)正在服用免疫抑制剂、非甾体类药物、激素等药物；(5)正在接受放化疗、免疫治疗；(6)近2周内服用过抗幽门螺杆菌药物，包括抗菌药物、质子泵抑制剂、铋剂等；(7)胃癌根治术后3个月内死亡。另选取同期60例体检健康者作为健康对照组。胃癌组中男112例，女36例；年龄25～84岁，平均(58.47±12.95)岁。良性病变组中男106例，女30例；年龄24～85岁，平均(58.05±12.17)岁。健康对照组中男46例，女14例；年龄24～84岁，平均(57.87±12.13)岁。3组研究对象性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会审核批准，患者或家属均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 RNA提取Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司，RNA酶抑制剂RNasin购自日本Toyobo公司，Oligo-dT18试剂盒购自北京赛百盛生物工程公司，SYBR Green 实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Stratagene公司，PCR Master Mix、MMLV反转录酶、DNA纯化试剂盒购自美国Promega公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。实时荧光定量PCR仪购自美国MJ Research公司，岛津UV-2201型紫外分光光度计购自日本岛津公司，ABI Veriti梯度PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.3检测方法 采集每例研究对象血浆2 mL，置于-80 ℃冰箱中冻存待测。按照Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取，应用紫外分光光度计对RNA提取液的吸光度值(A260)进行检测，计算浓度和纯度，在琼脂糖凝胶中电泳，检测RNA完整性。按照MMLV反转录酶说明书合成cDNA，置于-20 ℃冰箱中保存。实时荧光定量PCR检测p53、PVT1和miR-92a的表达。建立实时荧光定量PCR扩增反应体系，内参基因为β-actin，上游引物：5′-CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′； PVT1上游引物：5′-CATCCGGCGCTCAGCT-3′，下游引物：5′-TCATGATGGCTGTATGTGCCA-3′；miR-92a引物序列：5′-TATTGCACTTGTCCCGGCCTG-3′；p53上游引物：5′-GCTGAGTATCTGGACGACA-3′，下游引物：5′-CAGGCACAAACACGAACC-3′。扩增反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共计32个循环。用2%琼脂糖凝胶电泳及溶解曲线分离PCR产物。应用Tanon2500凝胶成像分析系统进行扫描，用目的基因A值与内参基因A值的比值表示目的基因miRNA的相对表达水平。

1.4术后随访 通过电话、门诊等方式对胃癌患者进行随访，从手术日期开始，术后2年内每3个月随访1次，第3年开始每3个月随访1次，第5年开始每年随访1次，随访截止时间为2020年8月5日，随访内容为询问患者病情，复查胃镜、腹部B超、胸部X线片、大便隐血试验等。总生存时间为手术日期至死亡或随访截止日期。

2 结 果

2.13组间外周血p53、PVT1和miR-92a表达水平比较 胃癌组血清p53、PVT1和miR-92a相对表达水平明显高于良性病变组和健康对照组，良性病变组也明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组间外周血p53、PVT1和miR-92a相对表达水平比较

2.2最佳截断值确定 根据ROC曲线选取外周血p53、PVT1和miR-92a表达的最佳截断值。p53最佳截断值为0.50，灵敏度为0.772，特异度为0.631；PVT1最佳截断值为0.95，灵敏度为0.719，特异度为0.585；miR-92a最佳截断值为1.78，灵敏度为0.790，特异度为0.624。

2.33项指标与胃癌患者性别、年龄、临床病理特征的关系 根据ROC曲线确定的最佳截断值，将148例胃癌患者分为p53高表达组(n=77)、p53低表达组(n=71)，PVT1高表达组(n=80)、PVT1低表达组(n=68)，miR-92a高表达组(n=72)、miR-92a低表达组(n=76)。不同性别、N分期胃癌患者外周血PVT1表达情况差异有统计学意义(P<0.05)。不同肿瘤分化程度胃癌患者外周血p53表达情况差异有统计学意义(P<0.05)。不同TNM分期胃癌患者miR-92a表达情况差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3项指标与胃癌患者性别、年龄临床病理特征的关系[n(%)]

2.4预后分析 148例胃癌患者的中位生存时间为46个月(4～135个月)。截至2020年8月5日，死亡104例(70.27%)，存活44例(29.73%)。比较不同性别、年龄、临床病理特征患者的中位生存时间显示，p53、PVT1和miR-92a表达水平低者的中位生存时间均明显长于表达水平高者，肿瘤最大径<4.25 cm、TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期和血小板计数<221.5×109/L者的中位生存时间也明显长于肿瘤最大径≥4.25 cm、TNM分期Ⅲ期和血小板计数≥221.5×109/L者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 148例胃癌患者的预后分析

续表3 148例胃癌患者的预后分析

2.5预后影响因素的单因素和多因素分析 单因素分析显示，血小板计数、肿瘤最大径≥4.25 cm、TNM分期Ⅲ期及血清p53≥0.50、PVT1≥0.95和miR-92a≥1.78均为影响胃癌患者预后的因素(P<0.05)。将上述差异有统计学意义的临床因素纳入Cox多因素分析，结果显示肿瘤最大径、TNM分期及血清p53、PVT1和miR-92a表达均是影响胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

2.6ROC曲线分析 ROC曲线分析结果显示，p53、PVT1、miR-92a及三者联合检测对判断胃癌患者预后的AUC(95%CI)分别为0.593(0.521～0.667)、0.603(0.519～0.675)、0.627(0.524～0.693)、0.882(0.327～0.934)，miR-92a单独检测对判断胃癌患者预后的AUC明显高于PVT1、p53单独检测，三者联合检测对判断胃癌患者预后的AUC明显高于各项指标单独检测，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 148例胃癌患者预后的单因素和多因素分析

3 讨 论

本研究结果显示，肿瘤最大径、TNM分期及血清p53、PVT1和miR-92a表达均是影响胃癌患者预后的因素。肿瘤最大径对胃癌的发展和患者预后有重要影响，原因主要与病灶大小、病理分化程度、肿瘤浸润深度和肿瘤侵犯邻近脏器范围等有关[8]。TNM分期是由国际抗癌联盟(UICC)制定的统一国际分期标准，是反映胃癌进展情况、局部和远处转移的一种简洁方法。TNM分期系统中，肿瘤侵犯深度和远处转移的淋巴结数目都是判断胃癌患者预后的决定因素，综合二者来判断肿瘤分期可用于预后指导，能更准确地反映肿瘤转移和患者预后情况。随着影像学技术、病理诊断技术等的不断发展，胃癌TNM分期系统近年来得到不断更新和完善，新的胃癌分期系统更合理，更加细化，这使得个体化差异也更明显，在判断患者预后方面发挥的作用也更明显[9]。尽管肿瘤最大径、TNM分期对判断患者预后有重要临床意义，但其结果均在胃癌根治术后才能获得，在减少术后胃癌复发和转移，以及降低患者病死率方面应用价值较低。近年来，随着分子生物学和基因学研究的进展，使得依靠分子生物学对胃癌进行预后判断和对其生物学特征的进一步了解成为可能，这对于提高早期胃癌诊断水平、准确评估其恶性程度和判断预后有重要价值。

p53基因是目前发现的与人类肿瘤相关程度最高且研究最为广泛的基因，由10个内含子和11个外显子组成。目前研究已经发现，p53蛋白能引起肿瘤形成或细胞转化，是一种肿瘤促进因子，而其是p53基因突变的产物，抑癌基因野生型p53基因失活在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。正常p53蛋白是一种细胞周期中增殖细胞的调节因子，能通过控制G0～G1期细胞进入S期而抑制细胞增殖，发生突变的p53基因会影响稳定蛋白抑制细胞增殖的作用，令肿瘤更易发生侵袭和转移[4]。有研究指出，p53基因的过表达在胃癌发生过程中起着非常重要的作用，其与胃癌的转移、浸润和预后均密切相关，其表达水平升高可能提示肿瘤有较高的深部浸润倾向和淋巴结转移能力，从而可导致胃癌患者预后不良[10]。本研究结果显示，p53高表达者的预后相比低表达者更差，这与上述以往研究结果一致。lncRNA是一类转录长度>200个核苷酸的RNA，无编码蛋白质的作用，但其多态性或表达异常与多种人类疾病有关。PVT1是一种重要的lncRNA，已经证实PVT1在包括肺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌等多种人类肿瘤中呈高表达，而且与肿瘤进展及患者预后关系密切，被认为是一种促癌性的lncRNA[6]。本研究结果也显示，胃癌患者外周血PVT1表达水平较健康对照者和胃良性病变者均明显升高，而且胃癌患者中，PVT1高表达者的预后较低表达者更差，其是影响患者预后的独立危险因素。PVT1表达升高影响胃癌患者预后的机制可能在于：(1)肿瘤细胞的PVT1高表达与原癌基因Myc miRNA表达密切相关，二者可共同扩增肿瘤，协同促进肿瘤形成和发展。(2)PVT1可作为一种竞争性内源RNA(ceRNA)与miRNA互相调控，影响细胞增殖和凋亡[11]。也有研究指出，PVT1过表达可减少miR-1204的生成，后者具有促进抗凋亡基因表达和细胞凋亡的作用[12]。此外，PVT1还可能通过转化生长因子β(TGF-β)信号通路的活化来抑制肿瘤细胞的凋亡。miR-92a定位于人基因组第13号染色体上，是由高度保守的miR-17-92基因簇编码的一种miRNA，研究发现其在人类多种恶性肿瘤中均呈现出过表达的状态。miR-17-92基因簇是潜在的致癌基因，这个基因簇中包括的miRNAs在多种肿瘤中的表达水平均升高，包括来自结肠、乳腺、胰腺、肺、胃、前列腺等的实体瘤和造血系统恶性肿瘤，其很可能参与了胃癌的调控，其中miR-92a被认为是非常重要的调控胃癌发生、发展的因子[13]。有研究发现，miR-92a在胃癌组织中高表达，采用miR-92a反义寡核苷酸(ASO)转染的人胃癌SGC-7901细胞呈现出明显的细胞凋亡征象，因此其被指出具有促进胃癌细胞增殖的作用[14]。还有研究指出，敲除miR-92a基因的结肠癌细胞的凋亡得到明显促进，其进一步证实miR-92a可通过抑制其靶基因Bim的表达来抑制结肠癌细胞的凋亡[15]。本研究结果显示，外周血miR-92a表达与胃癌患者TNM分期有关，是影响胃癌患者预后的因素，高miR-92a表达水平的胃癌患者预后不良。笔者推测miR-92a具有癌基因作用，其可通过对胃癌细胞增殖和凋亡的调控影响患者预后，但其具体的生物学机制还需扩大样本量进行研究。

此外，本研究通过ROC曲线分析确认了外周血p53、PVT1、miR-92a表达在胃癌患者预后评估中的价值，结果显示miR-92a单独检测对判断胃癌患者预后的AUC为0.627，明显高于PVT1、p53单独检测，联合检测判断患者预后的AUC为0.882，相比单独检测更高，这提示3项指标在胃癌患者预后评估中均存在一定价值，这3项指标的联合检测较单独检测具有更理想的预测价值，有望成为一种新的判断胃癌患者预后的肿瘤标志物。

综上所述，胃癌患者外周血p53、PVT1和miR-92a呈现高表达，且三者表达水平升高均是影响患者生存的独立危险因素。p53、PVT1和miR-92a联合检测对胃癌患者预后有一定的预测价值。